第二章基因工程制药新版4.pptxVIP

第三节 基因工程制药生产的基本过程;五、宿主细胞的选择和基因导入操作;（一）宿主细胞的选择;1、宿主细胞应满足的条件;2、宿主细胞的类型;（1）大肠杆菌;缺点：（1）表达产物多为胞内物质，提取时需破碎细胞。（2）细胞破碎时，细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来，形成杂质。给提取带来困难。（3）所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体，在提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。（4）大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统，不能对蛋白产物进行糖基化及磷酸化等修饰。（5）大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。（6）大肠杆菌会产生内毒素，难去除。 ;;（2）枯草芽孢杆菌;（3）链霉菌;（4）酵母菌; 至2004年，FDA共批准了酵母表达的基因重组生物技术药物8种： 胰高血糖素、巨细胞集落刺激因子、乙肝疫苗、胰岛素（Novolin）、水蛭素等。 虽然酵母表达系统表达的蛋白质有糖基化修饰，但是糖链结构和组成与天然糖蛋白相差甚远，对于那些糖链极大影响生物活性的蛋白质，如EPO、治疗性抗体等，仍不能用酵母表达系统表达。;（5）丝状真菌;（6）动物细胞; 至2004年，FDA共批准了哺乳动物细胞表达的基因重组生物技术药物53种，其中激素类5种，酶7种，细胞因子7种，凝血因子5种，治疗性抗体17种。 ;表达体系 产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性 大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大 融合蛋白质 部分高产 对真核差 酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大 糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物 哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意 糖基化蛋白 可高产 产物 致癌 ;（二）具体的转移技术;1、转化作用;（1）基本概念;（2）转化作用的特性;（3）感受态细胞;（4）人工感受态细胞;[5]转化程序;（6）影响转化的因素;转化过程总结示意图;2、转导作用;（1）基本概念;（2）转导条件;（3）转导程序;[A]、蛋白质体外包装???序;[B]、转导程序;（4）转导作用分类;3、脂质体介导的融合作用;（1）定义;（2）脂质体的特性;（3）脂质体介导融合的步骤;（A）人工脂质体的制备;（B）脂质体与宿主细胞的融合;（4）脂质体介导的应用;脂质体2000: Invitrogen?, 规格0.75ml/1.5ml??报价1700元/2900元?;4、显微镜注射技术; 是一种全新的基因导入技术，它把DNA包被在金或钨的微粒中，然后由基因枪将此包被颗粒转移到原位组织、细胞或细胞器中，是目前国际上最先进的基因导入技术。 基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、安全、高效的特点。 ;基因枪注射技术;利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。此法简单、效率较高，几乎所有细胞都可用此技术，此方法转染的DNA不仅是线性的，还可是环状的。条件：电压：300～600V 维持时间：20～100ms 温度：0℃;7、磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术;8、病毒介导的生物学方法 ;（三）大肠杆菌中的基因导入和表达;1、真核基因导入大肠杆菌所用的载体;pBV220;（1）pBV220;[A]、结构;质粒pBV220的结构框;[B]、优点;（2）pET;;2、真核基因导入大肠杆菌具体方式;（1）融合蛋白;[A]、定义;[B]、优缺点;[C]、改进措施;[D]、融合蛋白的具体表达方式;关键： 融合蛋白与外源蛋白的阅读框要对齐 两个蛋白的结合位点的设计很重要，应便于下一步切除融合蛋白的操作。;（D2）常用的融合蛋白（原核细菌表达蛋白质）;（D3）受体蛋白的切除方法;（2）非融合蛋白;[A]、定义;[B]、优缺点;[C]、非融合蛋白的具体表达方式;（C1）非融合基因—非融合蛋白;（C2）融合基因—非融合蛋白;（3）分泌型表达蛋白;[A]、定义;[B]、分泌蛋白表达的原理图示;[C]、常用的大肠杆菌信号肽;[D]、优缺点;3、影响真核基因在大肠杆菌表达的因素;（3）影响翻译水平的因素 ①核糖体结合位点的有效性直接影响基因产物的表达。 ② SD序列和真核基因起始密码ATG间的间距，会影响基因产物