第二章兰州大学基因工程基因工程酶学基础.pptxVIP

第二章 基因工程的酶学基础;第一节 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease); 主要来源于原核生物 1968年，Dr. Werner Arber, Dr. Daniel Nathan和Dr. Hamilton Smith博士第一次从大肠杆菌中提取出限制性内切核酸酶 已经分离提取出500多种限制性内切核酸酶; 内切酶，即在核酸分子内部制造切口的酶 形成5`-P 和3`-OH末端;a 限制（Restriction）;b 修饰（Modification）;c 限制修饰系统分子机理;;d 意义;二 限制性内切酶的命名;三 限制性内切酶类型;限制性内切酶的类型及其主要特性 ; II型限制性内切酶的基本特性;（2）切割位点;粘性末端 （cohensive end） ;; DNA 分子末端标记;一把特殊的剪刀—限制性内切酶的发现阿尔伯(Arber)、史密斯(Smith)和内森斯(Nathans)，获1978年诺贝尔生理学和医学奖; 同裂酶 (isoschizomers)： 来源不同，识别的是同样的核苷酸靶序列;;同尾酶(isocaudamer) ：来源不同，识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端 ;由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，称之为“杂种位点”(hybrid site)。但这类杂种位点的结构，一般不再被原来的任何一种同尾酶所识别;影响限制性内切酶活性的因素;DNA的纯度;;DNA的甲基化程度;反应温度;DNA的分子结构;核酸限制性内切酶的缓冲液;酶解反应中的星号活性;如EcoRI等,在正常条件下，切割5`GAATTC3`，但在甘油浓度5%时,也可切割5`PnPnATPyPy3`或者5`AATT3`;限制性内切酶反应的终止 ;完全消化和部分消化;完全消化;部分消化;双酶切的方法;使用限制酶的注意事项 ;;第二节 甲基化酶;2. 甲基化酶的用途 就许多II类限制性内切酶而言，都相应存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使其免受切割 甲基化酶的用途是在必要时可以封闭某一限制性内切酶的酶切位点,同时又可能产生新的酶位点 ; 如两个串联的TaqI识别位点经M．TaqI甲基化封闭后，出现了一个依赖于甲基化的限制性核酸内切酶DpnI的切割位点(下图) ;第三节 连接酶;一 DNA连接酶的发现;二 、特点;2 连接条件;3 DNA连接酶连接反应条件;三、连接反应机理;;;四、连接反应温度;五、影响因素;六、反应体系;七 、连接操作;八、体外连接DNA片段???几种方法;平头末端 （blunt end） 在识别位点的对称轴上同时切割，如EcoR Ⅴ;2、同聚物加尾法; 3、衔接物法 ;4、DNA接头法 ;第四节 DNA聚合酶;1、DNA聚合酶I反应条件;用途－ DNA杂交探针的制备 ;;缺口转移(nick translation) ;2、Klenow 酶;用途;;;3、T4 DNA 聚合酶;;;T4 DNA 聚合酶用途;;4、逆转录酶;;;;Taq DNA聚合酶;2. 用途 DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍 DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应，包括以下三个步骤： DNA模板变性(95℃) → 与DNA引物退火(45℃) → 引物延伸(72℃) ;Taq Pol 和PCR ;;第五节 核酸修饰酶;;;;;;;;;;;;;;;;第六节 单链DNA内切酶;;;;;;;;;;基因突变