westernblot试剂配制及操作步骤.docx

Western blot 试剂配制 1． 30％ 丙稀酰胺储存液 丙稀酰胺 29g N， N’-亚甲双丙稀酰胺 1g 双蒸水定容到 100ml ， 经高压蒸汽灭菌的滤纸过滤避光， 4℃保存于棕色瓶中 2． 1.5 M Tris-HCl (MW=121.1) pH 8.8 Tris 碱 90.75g 双蒸水 400ml 用浓 HCl 调 pH 至 8.8，加双蒸水定容至 500ml。 4℃冰箱保存 3． 1.0 M Tris pH6.8 Tris 碱 12g 双蒸水 60ml 用浓 HCl 调 pH 至 6.8， 加双蒸水定容至 100ml 。 4℃冰箱保存 4． 10％ SDS(w/v ） SDS 10g 溶于加水至 100ml ，室温放置 5． 10％ 过硫酸胺（ 10%APS ） 过硫酸胺 1g 溶于 10ml 双蒸水中。可在密闭的管子里 4℃保存一周 6． 10× Tris- 甘氨酸电泳缓冲液 Tris 30.3g 甘氨酸 144g SDS 10g 定容至 1000ml 室温 放置。 临用时稀释成 1×电泳缓冲液 7． 1%溴酚蓝（ w/v ） 溴酚蓝 100 mg Tris-base 60 mg MilliQ 水 定容至 10 ml 8． TEMED 原液， 4℃冰箱保存 9． 2× sample buffer(2 ×样品缓冲液 ) 1.0 M Tris pH6.8 2.5ml SDS 0.8g DTT 0.3085g 甘油 3ml 溴酚蓝 0.004g 加双蒸水至 10ml ，分装— 20℃保存 10. 4× SDS 加样缓冲液 10ml 1M Tris-HCl(ph:6.8) 2.5ml SDS 0.8g 溴酚蓝 0.004g 甘油 4ml Takara 5x buffer 总 5ml 1M Tris-HCl(ph:6.8) 1.25ml SDS 0.5g 溴酚蓝 BPB 25mg 甘油 2.5ml 500ul 每管分装，使用前将 25ul 的 2-ME 加到没管中 11．转膜缓冲液 Tris 碱 5.8g 甘氨酸 2.9g SDS 0.37g 甲醇 200ml 加双蒸水至 1000ml ，临用前配制， 4℃冷却 12． 1× TBST Tris 碱 3.0285 g 氯化钠 8.766g Tween-20 500ul 加双蒸水至 1000ml ，现配现用。（ 4℃最多保存一周） 13． n%封闭液 (一般 5%) 脱脂奶粉 n 克溶于 100ml 1 × TBST ， 4℃冰箱保存 附表 1 配制 Tris- 甘氨酸 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液 不同体积（ ml）凝胶液中各成分所需体积（ ml ） 溶液成分 5 10 15 20 25 30 40 50 6% 水 2.6 5.3 7.9 10.6 13.2 15.9 21.2 26.5 30%丙烯酰胺溶液 1 2 3 4 5 6 8 10 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.004 0.008 0.012 0.016 0.02 0.024 0.032 0.04 8% 水 2.3 4.6 6.9 9.3 11.5 13.9 18.5 23.2 30%丙烯酰胺溶液 1.3 2.7 4 5.3 6.7 8 10.7 13.3 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.003 0.006 0.009 0.012 0.015 0.018 0.024 0.03 10% 水 1.9 4 5.9 7.9 9.9 11.9 15.9 19.8 30%丙烯酰胺溶液 1.7 3.3 5 6.7 8.3 10 13.3 16.7 1.5 mol/L Tris (pH8.8) 1.3 2.5 3.8 5 6.3 7.5 10 12.5 10% SDS 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 10%过硫酸氨 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.4 0.5 TEMED 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012 0.016 0.02 12% 水 1.6 3.3 4.9 6