细胞工程第四章细胞培养1011.pptxVIP

动物细胞工程;本章主要内容： 培养细胞的生物学特性 常用培养液的组成和配制 细胞培养的基本方法 细胞系和细胞株的建立 细胞冻存复苏等细胞培养的技术;4.1 培养细胞的生物学特征;4.1.1 体外培养细胞的分型 ; 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 ; 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突???，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 ; 游走细胞型： 　　呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。单核细胞、巨噬细胞等。 ;多型细胞型： 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。神经元神经胶质细胞。 ;; 见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。 ;4.1.2 培养细胞的生长特点 ; 体外培养的小鼠子宫上皮细胞 (a) 消化分离得到的细胞团块； (b) 生长至第3天的细胞单层； (c) 生长至第4天的细胞单层； (d) 生长至第6天的细胞单层;4.1.2 培养细胞的生长特点 ;4.1.2 培养细胞的生长特点 ;4.1.2 培养细胞的生长特点 ;4.1.3 培养细胞的生长和增殖过程 ; 细胞系的生长过程; 每代细胞的生长过程 所谓细胞“一代”一词，仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。 如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。;3. 组织培养细胞一代生存期;理想的实验用细胞;4.1.5 体内外细胞的差异和分化;(1) 主要表现 失去原有组织结构和细胞形态 可能出现脱分化或去分化 细胞趋向单一化；;（2）与体内主要不同点 相对孤立、相对单一 缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 (3) 提示 要正确认识体外培养细胞 是一种特定条件下生长的细胞群体。;4.2 细 胞 培 养 液;4.2.1 细 胞 的 常 用 液 体;水：新鲜配置的三蒸水或超纯水 2.平衡盐溶液(balanced salt solution，BSS)又称生理盐水或盐溶液，是细胞培养中常用的基本液体。它主要由无机盐和葡萄糖配制而成，起着维持渗透压、缓冲和调节酸碱度等重要作用。 常用的缓冲液：生理盐水、PBS、PBS(注意有无钙镁离子)、 Hank’s液（含有钙镁离子、葡萄糖、酚红） 配液时注意：（1）用水；配制先后顺序；称量，要看清药品的规格、纯度、结晶水的数量等。（2）物质的纯度，常用的纯度有优级纯(特级纯)，分析纯（AR）和化学纯（CD）三种。（3）物质的可溶性，避免沉淀析出。（4）物质的稳定性，如葡萄糖只能在10磅下维持15～20分钟。（5）贮存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前临时混合和稀释，过滤除菌备用。;3;4. pH调节液 (1)碳酸氢钠液 可根据需要与使用方便配制10%以下的各种浓度。先用双蒸水溶解后，需经过滤除菌，分装小瓶中。亦可使用高压蒸气灭菌，密封，4℃冰箱保存。市售有5%～10%浓度的安瓿封装品，使用也很方便。在调节pH过程中或超过要求值时，可用高压灭菌的10%醋酸溶液或以CO2调节之。 (2)Hepes缓冲液 是一种可以保持细胞培养过程中pH值较长时间稳定的氢离子缓冲剂。通常使用浓度为10～15mmol/L。配制时，称取所需的Hepes量，用培养液溶解，用1mmol/LNaOH调节pH至7.0，过滤除菌分装小瓶中，4℃冰箱保存。;5 抗生素溶液(PS) 为防止细胞培养过程中发生污染，一般在培养液中加入青霉素钠盐和硫酸链霉素，其浓度分别为每毫升含100U和100μg 。配制时取青霉素1×106和链霉素1×106μg,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量为青霉素1×104U/ml，链霉素1×104μg/ml，使用时每100ml培养液中加入0.5-1ml。;6.;7.;4.2.2 细 胞 培 养 基;营 养 需 要;4.2.1细胞培养基;1.培养基;合成培养基;基本培养