生物化学实验示范报告-蔗糖酶的提取与纯化(正确).docx

生物化学实验示范报告 : 实验名称：蔗糖酶的分离提取与纯化 实验目的 : 1． 掌握蔗糖酶分离提纯的原理与实验操作方法； 2． 掌握有机溶剂分级纯化蔗糖酶的原理和操作方法，了解蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理； 3． 掌握酶活、酶比活等基本概念及测定原理、计算和操作方法； 4． 巩固并熟练掌握 Folin 法测定牛血清蛋白和 3、5 - 二硝基水杨酸法测定葡萄糖标准曲线制作方法， 并能通过回归方程测定还原糖及蛋白质的含量。 实验原理： 蔗糖酶分离提纯原理： 酵母中的蔗糖酶含量很丰富，实验以安琪酵母粉为原料，首先采用自溶法破 碎细胞壁、再用乙醇分级和 DEAE —纤维素柱层析两步分离提纯，制备纯度较高的蔗糖酶制剂。酶分离提 纯的原理与蛋白质的相同。但酶是有催化活性的蛋白质，在分离提纯过程中必须注意：防止酶变性失活； 随时测定酶的比活力，并跟踪酶的去向、衡量酶提纯的程度及得率。 有机溶剂分级纯化蔗糖酶原理： 利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂—乙醇中溶解度的差异将蔗 糖酶蛋白与其它蛋白质杂质进行有机溶剂分级沉淀，而使提取的蔗糖酶得以纯化（ 32％的乙醇饱和度沉淀 分离杂蛋白， 47.5 ％的乙醇饱和度沉淀分离酶蛋白） 。操作必须在低温下进行且避免有机溶剂局部过浓； 分离后应立刻除去有机溶剂并用水或缓冲溶液溶解沉淀的酶蛋白（复溶） ，确保酶的活性； pH 多选在酶蛋 白的等电点附近；有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度减少变性，提高分离效果。 蔗糖酶的离子交换层析法纯化原理： 本实验采用DEAE纤维素（DEAE-C11微粒状的、弱碱性的阴 离子纤维素为柱料，进行蔗糖酶的进一步纯化。它具有分辨率高、化学性质稳定、有开放性的长链结构、 有较大的表面积、对蛋白质的吸附容量大等优点；纤维素上离子基团的数量不多，排列疏散，对蛋白质的 吸附不是太牢固，用缓和的洗脱条件即可达到分离的目的，不致引起蛋白质的变性。 蔗糖酶活力与比活的测定： 在蔗糖酶的纯化过程中，通过 3、 5-二硝基水杨酸法测定蔗糖酶催化蔗糖 生成还原糖的量，测定酶活力大小，跟踪酶的活力。在本实验条件下，每 3min 释放 lmg 还原糖所需的酶 量定义为一个活力单位；通过 Folin 法测定酶蛋白的含量，计算蔗糖酶的比活。单位质量的酶蛋白中所含 酶的活力称为酶的比活。 主要实验器材： 1. 试管、血糖管； 2. 秒表； 3. 冰盐浴； 4. 恒温水浴； 5. 离心机； 6. 721- 型分光光度计； 7.柱层析装置；8.梯度洗脱装置；9.部分收集器；10.电磁搅拌器；11.冰箱；12. DEAE —纤维素。 )0 )0 3 3）．DEAE —纤维素离子交换层析法纯化： （由于实验条件和学时数所限,此步省略） 实验操作 1．蔗糖酶的分离提纯 （1）．蔗糖酶粗品的制备流程： 250mL具塞三角瓶+酵母粉+ 1.5g乙酸钠+ 25mL甲苯于35°C恒温水浴中搅 30min宀补加水60mL , 搅匀，用塑料薄膜封口，35C保温过夜 t自溶液于4000r/min离心20min，取中间水层液再次在 4000r/min 离心20min ,得无细胞抽提液（初酶Ei） t测量初酶液的体积 Vi,并取出5mL待测酶活力和酶蛋白浓度。 实验得到的初酶液体积 V1 = 48.5 mL ，留 5mL 测酶活及酶蛋白，其余 43.5mL 做后续纯化实验。 （2）．乙醇分级和透析流程： 将 43.5mL 初酶液用稀醋酸调节 pH 值至 4.5 t 32％的乙醇饱和度除杂蛋白（计算所需 95％乙醇的量 并与初酶液在冰盐浴中预冷，缓慢滴加 95 %乙醇并不断搅拌。滴加结束后，于 4000r/ min离心5min，留 取上清液） t 再用 95％乙醇调节酶液到 47.5％的乙醇饱和度,沉淀蔗糖酶（此时需准确计算出使粗酶液 的乙醇浓度达47.5%时所需补加95%乙醇的体积；按上述方法加入乙醇后于 4000r / min离心5min） t 透 析（ 沉淀立刻用 i0mL 0.005mol /L, pH6.0 的磷酸钠缓冲液溶解后, 转入透析袋中, 将透析袋放入 500mL 烧杯中,加清水透析过夜（中间换一次清水） t 次日,将透析液离心得酶液 E2 ,准确测量出酶液 E2 的体 积V 2,并取出5mL待测酶液，测定酶的活力和蛋白浓度。 实验得到的乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为 13.8 mL,考虑到初酶液留下的 5mL，则纯化后的 酶液体积校正后应为： V2 = 13.8 X 48.5 / （48.5-5） = 15.39 （mL）。 问题 i: 乙醇分级纯化的目的是什么？分级纯化后透析的目是什么 ? 2：乙醇分级和透析纯化后的酶液体积为什么需要进行校正？如何较正？ 2.牛血清蛋白和葡萄糖标准曲线定制 （1）