实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法.ppt

实验一蛋白质含量测定考马斯亮蓝染色法 第一页 Please be quiet, 上课了！！ 第二页 1、学习利用考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理及方法； 2、掌握分光光度计的使用方法； 3、掌握标准曲线的绘制。 一、实验目的： 第三页 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中游离状态下为棕红色。 当它与蛋白质通过范德华键结合后变为蓝色. 蛋白质染料复合物对595nm可见光有最大光吸收. 在一定范围内（ 10 -1000ug/ml）其OD595nm值与蛋白质含量成正比，故可用分光光度法进行蛋白质的定量测定。 二、实验原理： 第四页 考马斯亮蓝G-250染色法原理 465 nm 595 nm 酸性环境下呈棕红色 与蛋白质结合变蓝色 加入蛋白质 第五页 双缩脲反应： Folin-酚试剂法（Lowry法）： 紫外吸收法： 微量凯式定氮法： 其他蛋白质含量的测定方法 第六页 （1）双缩脲法： 原理是蛋白质含有两个以上的肽键（-CO-NH-）因此，有双缩脲反应，在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，故可以用来测定蛋白质含量. 第七页 （2）Folin-酚试剂法（Lowry法）： 是双缩脲法的发展，第一步涉及到碱性溶液中铜蛋白质复合物的形成，然后这个复合物还原磷钼酸－磷钨酸试剂，产生深蓝色（钼蓝和钨蓝混合物）比双缩脲法灵敏，但费时； 第八页 （3）紫外吸收法： 蛋白质中Trp，Phe，Tyr的残基中的苯环含有共轭双键，吸收高峰在280nm处，所以蛋白质具有吸收紫外光的性质，并且蛋白质溶液的光吸收值与其含量成正比，可用作定量测定。 简单、灵敏、快速、不耗样品，低浓度的盐类不干扰。 第九页 （4）微量凯式定氮法： 根据蛋白质的平均含氮量为16%，因此，测得1g蛋白氮，相当于6.25g蛋白质。 第十页 1、 实验材料：豆芽 2、仪器：(1)S-22pc可见光分光光度计 (2)研钵 (3)离心机 (4)试管 (5)容量瓶等 3、试剂： （1）染色液：考马斯亮蓝G-250 (100mg 考马斯亮蓝溶于50ml 95%乙醇，加100ml 85%磷酸，加水稀释至 1L) （2）浓度：0.25mg/ml的牛血清白蛋白标准溶液。 三、实验材料、仪器和试剂： 第十一页 1、制作标准曲线： 取7支试管，依次分别加入0.0，0.10, 0.15, 0.20, 0.30, 0.40, 0.50ml的牛血清蛋白溶液，用水补足到0.5ml，每管均再加5ml染色液，立即摇匀，置室温下放置5分钟。然后测各管的OD595nm 值，绘制标准曲线。 四、实验步骤： 第十二页 制作标准曲线： 编号 1 (空白） 2 3 4 5 6 7 样品 标准蛋白 (ml) 0.0 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 0.5ml 水 (ml) 0.5 0.4 0.35 0.3 0.2 0.1 0.0 浓度(mg/ml) 0.0 0.05 0.075 0.1 0. 15 0.2 0.25 C0 染色液(ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 OD值 第十三页 标准蛋白质浓度 OD值 0 样品OD值 C0 0.05 0 .075 0.1 0.15 0.2 0.25 OD1 OD2 OD3 OD4 OD5 OD6 标准曲线的制作（图） y=ax+b R2= 第十四页 标准曲线的绘制 目的：得到样品中蛋白质的浓度。 首先，用一组已知浓度的蛋白质溶液与考马斯亮蓝G-250反应,然后在595 nm处测定吸光度（OD）。 其次，绘制浓度与吸光度对应的曲线图。 最后，测定样品蛋白质的吸光度然后在曲线上找到对应的浓度。 第十五页 称取豆芽叶片2g → 研钵中加2ml水→研成匀浆→转入离心管→用水分三次冲洗研钵，每次2ml→均转入同一离心管 →等重后4000转/分离心15分钟→取上清液转入25ml容量瓶→定容。 2、样品蛋白质提取： 第十六页 吸取0.5ml提取液于试管中,加入考马斯亮蓝G-250 染色剂5ml，充分混匀，放置5分钟，测OD595nm，记录结果，查曲线，得蛋白质浓度C0(mg/ml)。 3、测定： 第十七页 分光光度技术 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称为分光光度计.