实验1大肠杆菌的培养与分离.docVIP

. . . word.zl. 实验1：大肠杆菌的培养和别离 一、教学要求 根本要求 1．进展大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进展细菌培养的操作 2．进展大肠杆菌的别离，用固体平面培养根本进展细菌的划线培养。 开展要求 说明大肠杆菌培养的条件和实验原理。 说明 二、根本容 微 微 生 物 的 实 验 室 培 养 培养基 无菌技术 别离、纯化大肠杆菌 培养基的配制 配制培养基的原那么 配制培养基的方法 计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板 平板划线法 稀释涂布法 系列稀释 平板涂布 1．培养基的种类和化学成份 培养基的种类有很多划分标准，按物理性质分：固体培养基和液体培养基〔参加琼脂多少〕。液体培养基用于扩大培养和工业生产，固体培养基用于菌种别离，鉴定，计数〔菌落数量〕。 培养基的化学成分包括 水 、 无机盐 、 碳源 、 氮源 、生长因子等。按照微生物的同化作用类型是自养还是异养，碳源不同，自养微生物为无机碳源，如硝化细菌是二氧化碳或碳酸盐，异养微生物为有机碳源，如大肠杆菌是葡萄糖等有机物。 2．常见微生物类群 原核生物〔如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等〕、原生生物〔草履虫、变形虫等〕、真菌〔酵母菌――出芽生殖.异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌〕、病毒等。 细菌是单细胞的原核生物，有细胞壁〔肽聚糖〕、细胞膜、细胞质，无成型的细胞核，只有一环状DNA分子〔拟核〕。以分裂〔二分裂〕的方式繁殖，分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌〔革兰氏染液染色后，再脱色处理，细菌仍保存染色液的颜色〕和革兰氏阴性菌两大类，区别在细胞壁的成分不同。大肠杆菌是革兰氏阴性〔细胞壁薄，有荚膜〕、兼性厌氧的肠道杆菌。 3．无菌技术 对实验操作空间、操作者的衣着和手进展清洁和消毒；将培养器皿、接种用具和培养基等器具进展灭菌；为防止周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进展；防止已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。 比较 理化因素的作用强度 消灭微生物的数量 芽孢和孢子能否被消灭 消毒 较为温和 局部生活状态的微生物 不能 灭菌 强烈 全部微生物 能 灭菌方法： ①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。 ②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱。 ③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅。 ④外表灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯。 4．培养基的配制原那么 目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。 营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。 pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。 5．实验操作步骤 〔1〕配制培养基：计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板〔形成斜面是为增大接种面积〕。 我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌，培养后可在LB固体培养基上划线别离。以下为本实验中培养基配置步骤： ①称量：准确称取各成分。蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。 ②溶化：加热熔化，用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂，整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。 ③调pH：用1mol/L NaOH溶液调节pH至偏碱性。 ④灭菌：在两个250ml的三角瓶中分别装入50ml LB液体培养基和50ml LB固体培养基，加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好，放入灭菌锅，1kg压力灭菌15min。 ⑤倒平板：灭菌后，待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进展。其过程是：①将灭过菌的培养皿放在火焰旁，右手拿装有培养基的三角瓶，左手拔出棉塞；②右手拿三角瓶，使三角瓶的瓶口迅速通过火焰；③用左手将培养皿翻开一条稍大于三角瓶口的缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖；④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。 倒过来放置的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基外表。向培养皿中转移已灭菌的培养基时，也不要把培养基沾在皿壁上。否那么，空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿培养基。 〔2〕接种 微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法。 平板划线法〔方法简单，考试的主要考察点〕：通过接种环在琼脂固体培养基外表连续划线的操