组织免疫共沉淀方法.pdfVIP

论坛里发的都是关于细胞的免疫共沉淀的实验方法 , 这是我做组织时 用到的方法 , 希望能给大家有点帮助 实验方法如下 : 第一步：制备组织裂解物 1. 把组织剪切成细小的碎片。 2. 融解 Western 及 IP 细胞裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使 用前数分钟内加入 PMSF,使 PMSF的最终浓度为 1mM。 3. 按照每 20 毫克组织加入 100-200 微升裂解液的比例加入裂解液。 ( 如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋 白样品，可以适当减少裂解液的用量。 ) 4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。 5. 充分裂解后， g 离心 3-5 分钟，取上清，即可进行后续的 PAGE、 Western 、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作。 6. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂 解，通过强烈 vortex 使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用 于 后续实验。 或 1.??使用洁净的工具用最快的速度切取待测组织。最好在冰上操作。 以防止蛋白降解 2.?? 将组织放入圆底离心管中，浸入液氮以达到“ snap freeze ”. 如果马上裂解则将组织冰浴，否则将组织保存 - 80°C 以备后用。 3.?? 每 5mg组织加入 300ul 裂解液，使用玻璃匀浆器匀浆， 直至充分 裂解。 4.?? 用 300ul 裂解液冲洗刀片两次，然后将组织液在 4°C 缓慢摇动 2 小时 5.??12000rpm 4 °C.离心 20 分钟。轻轻的将离心管取出冰浴，将上 清吸出到新的预冷的离心管中（保持冰浴），弃沉淀 。 裂解液的体积要根据组织量来确定。 蛋白提取物不能太过稀释一方面 避免蛋白的损失，另一方面也减少后续电泳的上样量（如果需要的 话）。蛋白的合适浓度为 1-5 mg/ml ，最低不能少于 mg/ml 。 第二步：预纯化裂解物 使用无关抗体或血清可以将裂解物非特异性结合 Ig 的蛋白去除，随 后加入的 agarose beads 一方面将裂解物中非特异结合 agarose 或 sepharose beads 的蛋白去除，另一方面也将加入的无关抗体和血清 蛋白去除。经过处理的裂解物所得试验结果背景更低、信噪比更好。 但如果最后是使用 WB来检测的话，预纯化就不是特别的必要了。 主要步骤： 1.??每 1ml 裂解物加入 50ul 和 IP 抗体来源及亚型相同的无关抗体 （例如后续免疫沉淀时用的是小鼠 IgG ，则在本步骤中可以加入 normal mouse IgG ）或者正常血清（常用兔血清），冰浴 1 小时 2.?? 加 100 μl Preotein A/G agarose beads， 4°C 缓慢摇动 10-30 分钟 3.??14,000 x g 4 °C 离心 10 分钟 4.?? 取上清，弃沉淀 为提高蛋白回收率，可将 Preotein A/G agarose beads( 上述沉淀 ) 用裂解液洗涤 1-2 次，所得上清和前面的合在一起 Note：要确保最大可能将正常血清（或无关 Ig ）从标本中去除。 第三步：免疫沉淀 1.??取 10- 500 μg细胞裂解物，加入推荐量的