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分子生物学实验思考题答案 分子生物学实验思考题答案 实验一、基因组DNA的提取 1、为什么构建DNA文库时，一定要用大分子DNA? 答、文库的大小(即数目)取决于基因组的大小和片段的大小，片段大则文库数目小一些也可以包含99%甚至以上的基因组。而文库数目小则方便研究人员操作和文库的保存。所以构建文库要用携带能力大的载体克隆尽量大的DNA片段. 2、如何检测和保证DNA的质量？ 答、用凝胶电泳看，有没有质白质和RNA等物质的污染，还可以测OD，用OD260/280来判断， 当OD260/OD280 1.8，表示蛋白质含量较高 当OD260/OD280 2.0，表示RNA含量较高 当OD260/OD280=1.8～2.0，表示DNA较纯。 实验二、植物总RNA的提取 1、RNA酶的变性和失活剂有哪些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 答、有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提取中用PEPC,Trizol 2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化。 答、、利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将mRNA从总RNA中分离出来 实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 1、感受态细胞制备过程中应该注意什么？ 答、A）细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保 存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。 B）所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心，悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂，影响转化。 C）经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，D） 化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000倍）； E）所使用的器皿必须干净。少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率； 2、感受态细胞制备可用在哪些研究和应用领域？ 答、在基因工程中将质粒导入受体细胞是如果受体细胞是细菌则将它用Ca2+处理变为感受态细胞质粒进入。 实验五、质粒在大肠杆菌中的转化和鉴定 1、在热激以后进行活化培养，这时的培养基中为什么不加入抗生素？ 答、活化培养用的一般是SOC培养基，这种培养基比LB培养基营养，此时进行的活化培养只是为了让大肠杆菌迅速复苏，恢复分裂活性，此时的细胞还不具抗性，加入抗生素会细胞会死亡。 2、什么是质粒？根据在细菌中的复制，质粒有几种类型？用于基因重组的主要用到哪些质粒？ 24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； 答、质粒是细菌体内的环状DNA分子。 质粒也是作为细菌遗传载体的一部分，但通常其携带的基因对细菌而言必要性要比核内DNA的小很多。比如，抗性基因，荧光蛋白基因等等。 根据质粒随细胞分裂而分裂的次数，将其分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。 常用于基因重组的质粒是pBR322质粒，因为其基因测序已经完成，而且它携带了两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因Apr，另一个是四环素抗性基因Tetr。 实验六、质粒DNA的分离纯化和鉴定 1、在实验过程中，加入的EDTA、SDS分别起什么作用? 答、EDTA可以结合DNA酶等，可以抑制其活性；SDS主要是裂解细菌和沉淀蛋白。 2、乙酸钾在实验过程中主要起什么作用? 答、主要是在分离过程中起着中和PH的作用，DNA经碱（NaoH)裂解后，染色体DNA氢键断裂，双螺旋解开，质粒DNA氢键断裂，互补链不能完全分离，再经乙酸钾中和成中性后则复性离心就可以达到分离的效果。 3、氯仿在核酸的提取过程中有何作用？ 答、克服酚的特点，加速有机层和液相的分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中迹量酚。 4、本实验整个过程中应该注意些什么？ 答、1、提取过程应尽量保持低温； 2、提取质粒DNA过程中除去蛋白质很重要，采用酚、氯