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造血干细胞分离培养方法 造血干细胞分离培养方法 PAGE / NUMPAGESPAGE / NUMPAGES 造血干细胞分离培养方法 一 造血干细胞分别 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(  羟乙基淀粉  )  积淀法 抽取髓液  500 m L  按 4∶ 1 比率加入  HES，自然沉降红细胞后，分别上清。  4℃ 400 g  离心  10 min 得细胞积淀物，以  1 %白蛋白盐水液冲洗细胞  2 次。 2 percoll  液密度梯度离心法 ①按体积比为～  2) ∶ 1  在骨髓液中加入淋巴细胞分别液。  4℃ ,1 5 00 r / min  ，离心  20 min  。取 单个核细胞层，以  1%白蛋白盐水液冲洗  3 次。 ②取鼠股骨和胫骨 , 在两头关节处切开骨骼 细胞悬液加在淋巴细胞分别液上 , 2 000 r / min  ,  屡次用培养基冲洗骨髓腔 , 随后小心地逐滴将 离心 20 min 。吸取离心后订交液面处的白色细胞 层即为单个核细胞。 3 Ficoll  分别法 离心  方法一 在 2000r/min  15ml 分别管中加比重为的 × 20min, 吸取白细胞层， 用  Ficoll 液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温 RPMI1640 液亲冲洗后离心 2000r/min × 10min, 取白细胞层 加 RPMI1640 液到  10ml  制成造血干细胞悬液样本。 方法二 取无菌离心管  1 支，起初增加  3mlFicoll(  与骨髓细胞悬液体积  1:1)  ，用滴管取单细胞悬 液 3ml ，沿离心管壁小心缓慢叠加于分别液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心  2000rpm × 分钟，（后续在冰进步行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中， 加入  5 倍以上体积的磷酸缓冲液  PBS， 1500rpm× 10  分钟，  L-DMEM冲洗细胞两次，每次以  1000r/min 离心  10min ，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用  PBS 缓冲液冲洗干净。在超 净台中腿骨浸泡在  PBS缓冲液中  5min ，此后在两头关节处切开骨骼  ,  屡次用  PBS缓冲液冲洗骨髓腔， 从而获取骨髓细胞悬液。 （二） Linc-- kit+  造血干细胞的分别纯化。 去除 Lin +细胞 ( 负精选 ) : 带有生物素的混杂抗体标记成熟细胞 ; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞 , 包括 T , B 淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞 ; 细胞经过磁 + + + 的磁珠吸附 CD117细胞 , 细胞经过磁场被柱子吸附的 CD117 细胞 ( 详尽操作步骤参照 M iltenyi 公司 MACS手册 ) 。 + （三）依照细胞表面 CD34抗原进行分别纯化 流式细胞仪检测骨髓 CD34+细胞：取 50μ L 细胞悬液 , 加入μ L CD45- FITC 和 10μ L CD34- PE 充分混杂 , 避光孵育 15 min 。以 PBS液冲洗并加多聚甲醛固定液 450μ L 固定 , 上机检测。 磁性标记 CD34+ 细胞：在细胞悬液中加入 100 μ L Fc - R 阻滞剂 , 再加入 100 μ LCD34 磁珠标记 细胞 , 于 4℃冰箱中充分混杂孵育30 min 。用 PBS 缓冲液冲洗细胞，离心10 min , 去上清液后再 以 500 μ L PBS 缓冲液重新悬浮细胞。 + MACS分别器的磁场中，以 500μ L PBS MiniMACS 磁性分别、纯化 CD34细胞：将 MS分别柱放置在 缓冲液漂洗。 以孔径 30μ m的尼龙网或过滤器去除细胞悬液凝块 , 细胞经过分别柱 , 以 500μ L PBS 缓冲液冲洗 3 次。 将分别柱从分别器中移出并放置在合适的试管中 , 于分别柱顶端滴注 P BS 缓冲 1 m L, 用分别柱装备的活塞加压将保留的细胞冲出。重复磁性分别步骤，将洗脱的细胞移至一个新的漂洗过的 MS分别柱冲洗，用 500μ L PBS 缓冲液洗脱保留的细胞。 二 造血干细胞培养 粒 - 巨噬细胞集落生成单位 (GFU-GM)培养（ CD34+细胞的培养） 采用甲基纤维半固体培养基系统进行集落培养。培养系统中含有  50μ g / L 重组干细胞生长 因子 ( rhSCF) 、 10μg / Lrh GM-CSF 、10μ g / L 重组白细胞介素