SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法要点.pdfVIP

SDS －PAGE 电泳过程中常见问题以 及解决方法 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行， 而所有条件总 要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集， 最 常用的就是 SDS －PAGE 电泳技术， 关于大家在此过程中经常遇到 的问题进行一些讨论： Q ：SDS －PAGE 电泳的基本原理？ A ：SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进 SDS （十二烷基硫酸钠）， SDS 会与变性的多肽，并使蛋白带负电 荷，由于多肽结合 SDS 的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其 序列无关， 因此 SDS 多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只 与多肽的大小有关， 在达到饱和的状态下， 每克多肽可与 1.4g 去污 剂结合。当分子量在 15KD 到 200KD 之间时，蛋白质的迁移率和 分子量的对数呈线性关系， 符合下式： logMW=K-bX ，式中：MW 为分子量， X 为迁移率， k 、b 均为常数，若将已知分子量的标准蛋 白质的迁移率对分子量对数作图， 可获得一条标准曲线， 未知蛋白质 在相同条件下进行电泳， 根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得 分子量。 Q ：配胶缓冲液系统对电泳的影响？ A ：在 SDS －PAGE 不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris － HCL 缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7 ，分离胶 pH8.9 ；而电泳缓冲液 使用的 Tris －甘氨酸缓冲系统。 在浓缩胶中， 其 pH 环境呈弱酸性， 因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而 CL 离子 却很高，两者之间形成导电性较低的区带， 蛋白分子就介于二者之间 泳动。由于导电性与电场强度成反比， 这一区带便形成了较高的电压 剃度，压着蛋白质分子聚集到一起， 浓缩为一狭窄的区带。 当样品进 入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动 速率增加， 直接紧随氯离子之后， 同时由于分离胶孔径的缩小， 在电 场的作用下， 蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。 所 以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因 素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 Q ：样品如何处理？ A ：根据样品分离目的不同， 主要有三种处理方法： 还原 SDS 处理、 非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的还原 SDS 处理。 1 、还原 SDS 处理：在上样 buffer 中加入 SDS 和 DTT （或Beta 巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成 SDS 与蛋白 相结合的分子， 在电泳中， 只根据分子量来分离。 一般电泳均按这种 方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样