有机溶剂沉淀法制备大豆脲酶.docVIP

PAGE / NUMPAGES 实验三有机溶剂积淀法制备大豆脲酶 一、实验原理 脲酶（）宽泛存在于微生物和动、植物组织中， 1926 年， Sumner J 曾用 32％的丙酮溶液从刀豆粉中提取脲酶，并获得了却晶。该酶相对分子质量 为 483000，由 6 个亚基构成，等电点 4.9,溶于水和稀缓冲液，粗酶较稳固，纯酶不太稳固，结晶酶在低温下可稳固 1 年以上。本实验用乙醇或丙酮从大豆种子中提取脲酶，并用有机溶剂和等电点联合法制备该酶。 二、实验步骤 1.提取 1）称取 5g 人造浮石，置小烧杯中，用 2％乙酸浸泡两次，倾去酸，加蒸馏水频频清洗至中性，沥干备用。 2）称取 10g 新鲜大豆粉，置入锥形瓶中，加上述人造浮石，加 50mL32％丙酮溶液，在冰浴中连续摇动 4min～5min,4 层纱布过滤，采集滤液。 3）将滤渣从头置于锥形瓶中，另加 10mL32％丙酮，再提取一次。 4 层纱布过滤，滤液在 4℃，3500r ·min- l 条件下离心 8min～10niln，当心倾出上清液，计量体积。取 lmL 酶液保留，供测酶活力和蛋白质用。 2.积淀 脲酶在 32％的丙酮中能够迟缓齐集而积淀，但当酶液在等电点邻近时，积淀生成更快。故： （ 1）将提取的酶液置冰浴中，在迟缓搅拌下，用点滴管逐滴滴加 2％醋 酸，其实不停用精细 pH 试纸检测 pH 变化，察看产生污浊的现象，直至 pH4 . 9 左 右。 置 4℃低温下留宿，可析出积淀。 2）将积淀物认真转入预冷的离心管， 3500：·而 n 一，离心 10～。上清液回收丙酮；积淀即为脉酶粗品。风干后，称重，计算酶的收得率。 1 / 3 3.重结晶 1）将所得粗酶溶于少量蒸馏水中，汲取 0.2mL～0.4mL 用于测定酶活力和蛋白质，此即粗酶的活力。 2）酶溶液在冰浴中冷至 2℃～4℃，搅拌下迟缓滴入等体积 64％的预冷丙酮溶液，保持低温条件下让其迟缓析出结晶，需要较长的时间，可获得较好 的正方形晶体。假如将溶液调至等电点结晶，则结晶速度较快，但晶形不够规整。结晶干燥后低温保留。 三、结果计算 酶收得率（ %)=（酶干重＋酶干重 x 测酶活留取液体体积／酶液整体积） ÷ 样品重 ×100% 酶的比活力［ U·mg-1，( pr.)]＝总活力／总蛋白质 报告试验结果及察看到的相关现象记录。酶制备记录表以下： 整体积 步骤 ( l）提取液 ( 2）粗酶 ( 3）结晶酶收得率 -1-1 U·ml 总活力 ( U )mg ml·总蛋白质（ mg) U·mg-1(pr.)( % )（ml）酶活力蛋白质 比活力 四、仪器与试剂 1.家用磨粉机、冰浴设施、离心计、 5mL、10mL、50mL 离心管、 1.5mL 塑料离心管及其余惯例仪器： 2 / 3 2.新鲜大豆或大豆粉； 3.人造移石（专用于吸附氨 Permutin 颗粒状人造浮石） ; 4.2％醋酸：冰醋酸 2mL 用蒸馏水稀释至 l00mL ; 5.64％和 32％丙酮：丙酮原液按体积百分比用蒸馏水配制。 3 / 3