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实验七琼脂免疫扩散试验 一 试验目: 了解双向琼脂免疫试验原理 掌握双向琼脂免疫试验操作方法 掌握双向琼脂免疫试验结果分析 二 试验原理: 当可溶性抗原(蛋白质、多糖、类脂、血清、多种微生物培养液等)与对应抗体在电解质存在合适条件下相遇, 经过一定时间出现肉眼可见沉淀现象, 称沉淀反应。 用于此反应中抗原又称沉淀原（precipitonogen）抗体则称沉淀素(precipitin)。 可溶性抗原与抗体在含电解质凝胶介质(通常见半固体琼脂, 起支持作用)内自由扩散, 当相对应抗原抗体相遇时, 若百分比合适可出现白色沉淀线, 称琼脂扩散试验 （agar diffusion test）。 沉淀线形状、位置, 与抗原浓度、扩散速度相关。 此方法可应用于以下方面: （1）抗原或抗体纯度判定。也可对抗体效价进行初步估算。 （2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗体） （3）抗原或抗体相对分子量估量 双向琼脂扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排孔型、梅花孔型（见图1） 图1 双向免疫琼脂扩散孔型 ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ 三孔型 双孔型 梅花孔型 双排孔型 三 试验材料: 1.高盐生理盐水琼脂糖 2.待检血清、法氏囊抗原、法氏囊阴、阳性抗体 3.载玻片、湿盒、吸管、打孔器、37℃恒温箱、可调微量加样器等 四 操作步骤: 1. 制板: 用移液管吸收热琼脂3.5ml, 平铺于载玻片上。 2. 打孔: 待琼脂凝固后, 按图1梅花孔型打孔, 孔径3mm,中心孔与边缘孔距离3-5mm。用针头斜面向上轻轻挑去孔内琼脂（勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底）。 3. 封底: 用酒精灯轻烤平皿底部致微烫, 封闭孔底部, 以防侧漏。 4.加样: 用微量加样器将法氏囊抗原10ul加入中间孔内; 将待检血清用生理盐水稀释成1: 2、1: 6、1: 10 以及空白（生理盐水）加入周围各孔中, 每孔10ul 。 5.将玻璃片置于湿盒内, 于37℃温育, 隔天观察结果。 二、双向琼脂扩散试验 结果观察: 沉淀线位置、数目与形状等。 图4 抗原特异性与沉淀线形状关系 a、b: 抗体 A、A’、B: 抗原A、B完全不一样 A、A’部分相同 五 注意事项 1.用琼脂浇载玻片时, 载玻片必需保持水平位置, 玻片要清洁, 边缘要整齐, 加琼脂糖时要避免产生气泡。 2.每个孔加样量应保持一致, 既使每个孔都被加满, 又必需不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。 六 思索题 1.画出个孔间沉淀线位置、数量、形态, 并给予简单说明 2.对试验结果进行分析