WB完整步骤[参考].pdf

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶 转移胶（转膜） 封闭和孵抗体 扫膜 一.配胶 这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺 ”比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达 到最小值。 SDS 聚丙烯酰胺凝胶大多按 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺 ”为 1：29 配制， 试验表明它 能分离大小相差只有 3% 的蛋白质。 1.分离胶 （按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶 均可事先配好（除 AP 及 TEMED 外），过滤后作为储存液避光存放于 4℃，可至少存放 1 个月， 临用前取出室温平衡 （否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析 出而导致气泡，有条件者可真空抽吸 3 分钟），加入 10%AP （0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高 AP 浓度越低， 15%的分离胶可用到 0.5:100 ）及 TEMED （分离胶用 0.4:1000, 15% 的可用到 0.3:1000 ，浓缩胶用 0.8 ：1000） PAGE 配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在 《分子克隆》上有详细的论述， 相信大家都不难查到。 容易忽视的问题主要在于过硫酸铵 （AP ） 一定要新鲜 —— 最好用小指管配 AP （写日期）保存在 -20 度，超过 2 周的 AP 扔掉算了，或 者已经反复打开使用多次的 AP 都别用， 二制胶 1.灌入 2/3 的分离胶后应立即封胶，即压线。 30 分钟 胶浓度＜ 10%时可用 0.1% 的 SDS 封，浓度＞ 10%时用水饱和的 异丁醇 或 异戊醇 ，也可 以用 0.1% 的 SDS 。封胶后切记，勿动 。 如用醇封胶需用大量清水及 ddH2O 冲洗干净， 然后加少量 0.1% 的 SDS ，目的是通过降低张 力清除残留水滴 10%的 AP 最好现配现用，如在 4 ℃存放勿超过两周。 30% 的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉 过硫酸铵（ APS ）(10%;w/v) 取 3g 过硫酸铵， 溶于去离子水， 至终体积为 30mL 。此溶液 4 ℃下在短暂的数日内是稳定的， 但建议，对每一组新胶均应新鲜配制 但摇动溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气 2.灌积层胶 5% （统一） 40min 说明：可延长，宁长勿短。防止凝固不均匀，形成月牙状。 三．跑胶 1.配制 running buffer ： 1) tris 3g ； 2) Glycine:甘氨酸 14.4g 在被分析的蛋白质稳定的 pH 范围，凡是不与 SDS 发生相互作用的 缓冲液 都可以使 用，但缓冲液的选择对蛋白带的分离和电泳的速度是非常关键 的。 - Tris 甘氨酸系 统是目前使用最多的缓冲系统。 如果要测定糖蛋白的分子量， 最好采用 Tris- 硼酸盐缓冲系统， 对于分子质量小于 15 kDa 的蛋白样品，可以使用 SDS-尿素系统，也可以采用 Tris-tricine 缓冲系统。 甘氨酸并非作为缓冲成分参与，而是作为尾随离子来参与电泳过程 3) 10%SDS 10ml ； SDS 能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱 氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的