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实验四 细菌的涂片及简单染色法和革兰氏染色法（经典法） 【目的要求】 学习并了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。 掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。 了解革兰氏染色法的原理，并掌握其操作方法。 了解革兰氏染色法在细菌分类鉴定中的重要性。 学习并掌握微生物涂片、染色的基本技术和无菌操作技术。 巩固显微镜(油镜)的使用方法。 【基本原理】 一、细菌的涂片及简单染色法基本原理 细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。 　　所谓简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，可用以观察微生物的形状、大小及细胞排列状态，是微生物技术中应用广泛，操作简便的染色法。 【实验用品】 1、菌种 金黄色葡萄球菌，大肠埃希氏菌（注：大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰氏阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着上不同颜色，在显微镜下便于区别。同时，由于两者具有不同的个体形态，在对它们的混合涂片进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。） 2、仪器 显微镜(25台)； 3、材料 载玻片（每组4个），酒精灯（每组1个），接种环（每组1个），擦镜纸，二甲苯、香柏油，吸水纸，染色缸等； 【实验用品】 4、染料 草酸铵结晶紫（Crystal Violet , CV）、沙黄、吕氏碱性美蓝染液。 　　1）草酸铵结晶紫染液的配制： 　　A液： 结晶紫 2g 　　 95％乙醇 20ml 　　B液： 草酸铵 0.8g 　　 蒸馏水 80ml 　　需在用前48h将A液、B液混合，装入棕色试剂瓶内备用。 【实验用品】 　　2）沙黄染液的配制： 　　 A. 贮存液： 沙黄 2.5g 　　 95％乙醇 100ml 　　 B. 应用液： A液 10ml 　　　　　　　　蒸馏水 90m 【实验用品】 　　　3）吕氏(Loeffler)碱性美蓝染液 　　　A液：美蓝(methylene blue) 0.6g 　　　　　 95%酒精 30ml 　　　B液：KOH 0.01g 　　　　　 蒸馏水 100ml 　　　分别配制A液和B液，配好后混合即可。 【方法步骤】 一、细菌的涂片及简单染色法 涂片 固定 染色 水洗 干燥 镜检 清理 干燥 【方法步骤】 图1 涂片、干燥和热固定 【方法步骤】 二、革兰氏染色法（经典法） 1、涂片 在洁净无油腻的玻片滴两小滴蒸馏水，用灼烧灭菌冷却后的接种环挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成极薄的菌膜，两种细菌要混合的地方。 2、固定 将制成的涂片自然干燥，冷却后固定，固定时通过火焰1-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜。 【方法步骤】 3、染色 　　⑴初染 将玻片置于玻片搁架上，加草酸铵结晶紫染色液(加量以盖满菌膜为度)，染色1-2min。倾去染色液，用自来水小心地冲洗。 　　⑵媒染 滴加(Lugol)碘液，染1-2min，水洗。 　　⑶脱色 滴加95%乙醇2-3次，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色。（此步至关重要）。 　　⑷复染 滴加0.5%沙黄，染色2-3min，水洗。最后用吸水纸轻轻吸干。 【方法步骤】 4、镜检 干燥后，置油镜观察。被染成紫色者即为革兰氏阳性菌(G)；被染成红色者是革兰氏阴性菌(G-)。 右图为革兰氏染色法显示的炭疽和金黄色葡萄球菌 【方法步骤】 【注意事项】 难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间。当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。 选用对数生长期的细菌为宜。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。 涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。 【实验报告】 1．结果 　　1）绘出油镜下观察的菌体图像 革兰氏染色效果 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 混合菌 【注意事项】 玻片要洁净无油，否则菌液涂不开。 挑菌量宜少，涂片宜薄，过厚则不易观察。 制片要完全干燥后才能用油镜观察。 革兰氏染色成败的关键是脱色时间。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响， 2）填表 　　　 表1 细菌形态的描述 【实验报