SDS-PAGE电泳过程中常见问题以及解决方法.docVIP

word word PAGE / NUMPAGES word SDS－PAGE电泳过程中常见问题以与解决方法 几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进展，而所有条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并进可能减少其相互间的聚集，最常用的就是SDS－PAGE电泳技术，关于大家在此过程中经常遇到的问题进展一些讨论： Q：SDS－PAGE电泳的根本原理？ A：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS〔十二烷基硫酸钠〕， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，。当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，假设将分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在一样条件下进展电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？ A：在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，别离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入别离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于别离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进展别离。所以，pH对整个反响体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。 Q：样品如何处理？ A：根据样品别离目的不同，主要有三种处理方法：复原SDS处理、非复原SDS处理、带有烷基化作用的复原SDS处理。 1、复原SDS处理：在上样buffer中参加SDS和DTT〔或Beta巯基乙醇〕后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来别离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，参加上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。 2、带有烷基化作用的复原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久结实的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20％的碘乙酸胺，并在室温保温30min。 3、非复原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1％SDS沸水中煮3min，未加复原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 Q：SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？ A:聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂与环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，别离胶选择pH8.9，选择tris－HCL系统，具体作用后面介绍； TEMED与AP：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固； 十二烷基硫酸钠〔SDS〕：阳离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子的疏水作用、去多肽折叠。 Q：提高SDS电泳分辨率的途径？ A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 Q：“微笑〞〔两边翘起中间凹下〕形带原因？ A：主要是由于凝胶的中间局部凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理方法：待其充分凝固再作后续实验。 Q：“皱眉〞〔两边向下中间鼓起〕形带原因？ A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理方法：可在两板间参加适量缓冲液，以排除气泡。 Q：为什么带出现拖尾现象？ A：主要是样品融解效果不佳或别离胶浓度过大引起的。 处理方法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 Q：为什么带出现纹理现象？ A：主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理方法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 Q：什么是“鬼带〞，如何处理？ A：“鬼带〞就是在跑大分子构象复杂