临床检验技师临床免疫学和免疫检验固相膜免疫测定讲义.pdfVIP

第十二章 固相膜免疫测定 第一节 概述 固相膜免疫测定以 微孔膜 作为固相。固相膜的特点在于其多 孔性、非共价键 高度吸附 抗体或抗原 和易 于漂洗等，固相膜像滤纸一样，可被 液体穿过 流出，液体也可以通过毛细管作用 在膜上向前移行 。标记物 可用酶或各种有色微粒子，如彩色胶乳、胶体金或胶体硒等。 一、常用的固相膜 固相膜免疫测定中常用的膜为硝酸纤维素（ NC）膜以及玻璃纤维素（ fiberglass ）膜、尼龙（ nylon ） 膜、聚偏氟乙烯（ PVDF）膜等。其中最常用为 NC膜 。 二、固相膜的技术要求 1. 孔径：用于 穿流法 的膜一般选择 0.4 μm左右，用于 横流法 的膜可选择 5～10 μm。 2. 流速：孔径大，流速快。 2 3. 蛋白质结合力：吸附力很强，以 μg/cm 表示。 4. 均一性：优质的膜应具有良好的均一性，这样才能保证试剂批内的均一性。 第二节 免疫金标记技术 利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标志 物在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见 红色或粉红色斑点 ，因而用于 定性或半定量 的快速免疫检测。这 一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色（ IGSS）。 一、胶体金的制备 （一）制备原理：一般采用 还原法 ，常用的还原剂有 枸橼酸钠 、鞣酸、维生素 C、白磷、硼氢化钠等。 向金溶液内加入还原剂，使金离子还原成 金原子 ，形成金颗粒悬液，也称金溶胶。 （二）技术要点：金溶胶的光散射性与 溶胶颗粒的大小 密切相关，一旦颗粒大小发生变化，光散射也 随之发生变异，产生肉眼可见的显著的颜色变化，这就是金溶胶用于免疫沉淀或免疫凝集试验的基础。 （三）注意事项 1. 玻璃容器的清洁：玻璃表面污染会干扰胶体金颗粒的生成，用前经过 强酸洗，后硅化 。 2. 试剂、水质和环境：氯金酸极易吸潮，对金属有强烈的腐蚀性， 不能使用金属药匙 ，避免接触天平 称盘。其 1%水溶液 在 4 ℃可稳定数月不变，实验用水一般用双蒸馏水，实验室中的尘粒要尽量减少，否则 实验的结果将缺乏重复性。 二、免疫金制备 （一）制备原理： 蛋白质 被吸附到胶体金颗粒表面而结合的过程。 （二）技术要点 1. 胶体金溶液的 pH：原则上可选择待标记蛋白质等电点，也可略为 偏碱 。 2. 蛋白质最适标记量 （三）注意事项 多种蛋白质、葡聚糖、 PEG2000、明胶等均为良好的高分子稳定剂， PEG和 BSA是最常用的稳定剂 。稳 定剂有两大作用： ①为保护胶体金的稳定性，使之便于长期保存； ②为防止或减少免疫金复合物的 非特异性吸附 反应。 第三节 膜载体免疫测定的种类与原理 第 1 页 一、斑点免疫渗滤试验（ IFA ） 用于检测各种传染病的抗体和肿瘤标记物等，以及用于检测尿液 HCG的“金标”早孕诊断试剂。 （一）原理： 将抗原或抗体 点加 在固相载体 硝酸纤维素薄膜 上，将膜贴于吸水材料上，依次在膜上滴 加标本、免疫胶体金及洗涤液等试剂进行抗体或抗原反应，过量试剂很快渗入吸水材料中。 抗原抗体反应后，形成大分子胶体金复合物，从而使阳性结果在膜上呈现 红色斑点 。液体通过微孔滤 膜时，渗滤液中的抗原或抗体与膜上的抗体或抗原相接触，起到亲和层析的浓缩，达到快速检测的目