《基因突变及其机制》课件.ppt

精选课件ppt 烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。因此，化学诱变剂要现用现配。不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用一样，有的分解产物会失去诱变作用或具有毒性。因此，保藏时要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。 一般烷化剂杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。但烷化剂多数极毒，能致癌，所以无论在配制药品、诱变操作及诱变后器皿处理时，都要小心谨慎，注意安全，避免直接接触身体以及防止污染环境。下面介绍几种常用的烷化剂： 2、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(简称亚硝胍，NTG，NG或NG或MNNG) 亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。 NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株，而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。NTG还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。 NTG在水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2，HNO2自身就具诱变作用；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷(CH2N2)，对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备菌悬液都要用适宜的缓冲溶液。常用的有磷酸缓冲液和Tris缓冲液。 NTG的诱变处理方法： ①取新鲜的斜面，用一定pH值的磷酸缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌作成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子(真菌或放线菌)须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，则可用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107/mL； ②配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酚胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1(缓冲溶液9mL：NTG丙酮溶液1mL)，一般NTG母液浓度配成lmg/mL。使用时取母液0.2mL，加菌悬液1.8mL，NTG最后处理浓度为100ug/mL。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100-1000ug/mL，而放线菌、真菌孢子为1000-3000ug/mL。 ③混合保温，将以上菌悬液和NTG溶液盛于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温(细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃)处理若干时间，一般细菌为20-60min，孢子90-120min。 ④终止反应：用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，把表型稳定的突变细胞培养液进行稀释分离到平皿上。 处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理。 摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加入5-10ug/mLNTG，并加几滴吐温80或吐温60，使成乳化状(注意吐温对该菌生长是否有影响)； 在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混合制成平板,NTG浓度为l0-50ug/mL。或将琼脂培养基制成平板，然后将NTG和菌体混合涂抹平板，此时NTG浓度为10-20ug/mL。 经过培养的培养液，除部分进行平板分离外，剩余的培养液可以加入适量的药物，保存于冰箱内数天。如日本有人把经过NTG处理后的大肠杆菌培养液，用50%甘油水溶液加入1/3容积(最终浓度为12.5%)于-40℃、-80℃保存。在以后数天内随时可取出融化，稀释分离，突变体死亡很少。如果要把培养液直接置冰箱保存，通过试验确定一种适合低温保存的培养基，使它们在保存期间总菌数的死亡率和正突变体的死亡率都降低到最小值。 无论是用辐射线处理，还是用化学诱变剂处理后的菌悬液或后培养液，浸在冰水浴中2-3h，试验的重复性很好。认为在大肠杆菌、枯草杆菌和放线菌等可以采取这一措施来提高诱变效果。 NTG是一种强烈的致癌物质，操作时要带橡皮手套，穿工作服，带口罩，用称量瓶称量，最好在通风橱中进行。凡接触过NTG的器皿必须及时、单独处理，例如用自来水大量冲洗或用1-2m