临床检验技师临床免疫学和免疫检验放射免疫分析讲义.pdfVIP

第七章 放射免疫分析 第一节 放射免疫技术 一、基本类型及原理 （一）放射免疫分析（ RIA ）以放射性核素标记抗原 与 未标记抗原竞争结合 特异性抗体，测定样品中 抗 原量 的一种分析法。 （二）免疫放射分析（ IRMA）用放射性核素标记 的过量抗体与待测抗原直接结合， 固相免疫吸附载体 分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析法。 二、常用的放射性核素 125 131 3 14 125 I 、 I 、 H、 C等，使用最广泛的是 I 。 三、放射性标记物制备及鉴定 （一）原理：以 放射性碘原子 置换被标记物分子中 酪氨酸 或 酪胺残基 以及组胺残基上的 氢原子 。蛋白 125 质、肽类等含有上述基团，可用 Ⅰ直接标记，不含上述基团的甾体激素或药物分子，须连接相应基团才 能用于放射性碘标记。 （二）标记及类型 1. 直接标记法：肽类、蛋白质和酶的碘化标记。 常用的方法为：①氯胺 T （ch-T ）法；②乳过氧化物 酶标记法。 2. 间接标记法： 也称连接标记法，是 最常用 的间接碘标记方法。该法主用于 甾体类化合物、环核苷酸、 前列腺素等 缺乏碘标记基团的小分子化合物的标记。 （三）放射标记物的纯化 1. 凝胶过滤法： 分子筛机制。 125 2. 离子交换层析法： 游离 Ⅰ与标记物分子极性差异进行吸附解离。 3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳法（ PAGE）： 按分子所带电荷和直径不同在电场作用下分子迁移速率不同。 4. 高效液相色谱法。 （四）放射标记的鉴定 1. 放射化学纯度：单位标记物中结合于被标记物上的放射性占总放射性的百分率，要求 ＞95%。该参数 还是观察在 贮存期内标记物脱碘 程度的重要指标。 2. 免疫活性：制备的标记物与抗体结合的能力。 3. 比放射活性：单位化学量标记物中所含的放射性强度，即每分子被标记物平均所结合放射性原子数 目。 四、方法学评价 除常规的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性等指标外，还应注意以下指标： （一）可靠性：又称健全性，是评价 被测物与标准品 的免疫活性是否相同。借助 标准曲线与样品稀释 曲线 的平行性分析来判断。平行性好者可靠。 （二）剂量- 反应曲线：通过已知浓度的标准品和相应的反应参数绘制成剂量 - 反应曲线，待测物定量 是通过计算其反应参数在剂量 - 反应曲线上对应的标准品浓度值而确定。 （三）高剂量钩状效应：标本中被测物浓度 超过 线性范围上限时，所得结果反而 降低或呈阴性 的现象。 可以通过选用 髙亲和力抗体 或对此类标本进行 稀释 后测定以改善或消除。 第二节 放射免疫分析 放射免疫分析（ RIA）是以 放射性核素 作示踪剂的标记免疫分析方法，特别适用于激素、多肽等的 超微 第 1 页 量 分析。 一、基本原理 经典 RIA 是采用标记抗原和非标记抗原竞争性结合有限量特异性抗体的反应。 二、实验方法及测定 （一）抗原抗体反应：将未标记抗原（标准品和待测样品）、标记抗原和特异性抗体加入反应试管中， 在一定条件（温度、时间及介质 pH）下进行竞争抑制反应。 先加 待测样品 （或标准品）和 抗血清 ，使非标记抗原与抗体达到结合平衡，然后再加入 标记抗原 竞争 与抗体结合。 （二）分离结合与游离标记物： RIA 反应平