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实验步骤 第三十页，共46页。 流程示意图 第三十一页，共46页。 TaqMan法举例 材料准备 从正常肺组织中提取的总 RNA 从肺癌组织中提取的 总RNA -Trizol -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮 -RNA保存液 小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材 最常用 第三十二页，共46页。 反应体系 dNTP?Mixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O 第三十三页，共46页。 第一页，共46页。 优选包括引物设计 第二页，共46页。 PCR： 国王和象棋的故事 N = 264 -1 = 18446744070309551615 第三页，共46页。 PCR：伟大的天才发明 PCR原理简介 第四页，共46页。 PCR：理想与现实 反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 终点检测，与看家基因对照，所谓 ‘半定量’：不可接受。 第五页，共46页。 实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 第六页，共46页。 实时荧光定量PCR原理定量原理 介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值 如何对起始模板定量？ 通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析 通过看家基因和目的基因的Ct值进行相对定量 第七页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线 扩增曲线图： 横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集 荧光基团 荧光检测元件 第八页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 -------荧光阈值 荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值 第九页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 C(t) value 第十页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性 横轴：PCR反映循环数 纵轴：荧光信号量 Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 第十一页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理 理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 第十二页，共46页。 实时荧光定量PCR 原理 --------- 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 第十三页，共46页。 确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量 Sample 实时荧光定量PCR原理 绝对定量 25 第十四页，共46页。 以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度 -ΔΔ Ct法 成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的样本之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负10% 实时荧光定量PCR原理 相对定量 第十五页，共46页。 讲 座 提 纲 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用 第十六页，共46页。 非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqM