第十五章DNA重组技术的基本原理.pptxVIP

第十五章 DNA重组技术的基本原理第一节 DNA重组的技术要件DNA重组技术：基因工程亦称遗传工程，即利用DNA重组技术方法，把DNA作为组件，在细胞外将一种外源DNA（目的基因）和载体DNA重新组合连接（重组），最后将重组体转入宿主细胞，使外源基因DNA在宿主细胞中，随细胞的繁殖而增殖（cloning克隆），或最后得到表达，最终获得基因表达产物或改变生物原有的遗传性状。基因工程的关键技术是DNA重组，但二者并不等同。+Foreign DNA to be insertedJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeCloningSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculeDNA重组的 技术路线1、目的基因的制备2、载体的构建3、目的基因与载体的重组4、重组 体导入宿主细胞进行扩增5、克隆基因的鉴定Plansmid vector一、重要的工具酶及其作用特点一般把DNA 分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。（一）限制性内切酶限制性内切酶（Restriction endonuclease）：是一类以环状或线形双链DNA为底物，能识别DNA中的特定核苷酸序列，并在合适反应条件下，使每条的一个磷酸二酯键断开，产生３-OH和5 -P基团DNA片段的内脱氧核酸酶(endodeoxyribonuclease)。（二）DNA连接酶DNA连接酶（ligase）：能够催化两个DNA片段末端之间的-P基团和-OH基团形成磷酸二酯键的酶。（三）DNA聚合酶（四）逆转录酶（五）RNA聚合酶二、目的基因的载体类型及其功能载体（vector）: 能够携带外源基因进入受体细胞的DNA分子。基因克隆载体必备条件：（1）受体细胞本来就有的或受体细胞可以接受的；（2）具有能使外源DNA片段插入的多克隆位点（ MCS，multiple cloning site）；（3）能进行自我复制，具有复制原点（ORI，origin ）；（4）具有选择标记，承载外源DNA片段的载体进入细胞后，以便筛选克隆子。（一）质粒及其功能（二）噬菌体及其功能（三）考斯质粒（四）动物病毒的载体作用（五）植物寄生菌作为目的DNA的载体　Ti质粒（Ti plasmid）：是一种细菌质粒，存在于土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens） （革兰氏阴菌）细胞中，可诱导植物产生瘤细胞( Tumor- inducing, Ti )，冠瘿瘤（grown gall　tumors)。 　诱导植物产生瘤细胞第二节 DNA重组的基本技术步骤1、目的基因的制备2、目的基因与载体的重组3、重组 体导入宿主细胞进行扩增4、克隆基因的鉴定+Foreign DNA to be insertedJoiningRecombinant DNA molecule Introduction into host cells by transformation of viral infection Host chromatemeCloningSlection for cells coteining a recombinant DNA moleculePlansmid vector一、目的基因的制备方法基因工程的主要目的是通过优良性状相关基因的重组，获得具有高度应用价值的新物种。　为此，必须从现有生物群体中，根据需要分离用于克隆的此类基因，这样的基因通常称为目的基因。（一）建立DNA文库某种生物基因组全部遗传信息的一系列DNA片段，通过克隆载体贮存在一种受体菌的群体之中，这种包含某生物基因组全部DNA片段受体菌群体（一套克隆）称为这种生物的基因组文库。 基因组文库建立顺序基因文库和cDNA文库的建立组织载体DNAmRNAcDNA部分或完全酶解DNA甲基化，双链接头DNADNA长度分级可克隆之DNADNA与载体连接引入大肠杆菌扩增后供长期储存筛选出所需要的克隆鉴定文库的滴度和特性（三）人工合成DNA片段（四）聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA 1 PCR的原理：1985年Mullis发明PCR（ polymerase chain reaction）快速扩增DNA的方法。该法模仿体内DNA的复制过程，首先使DNA变性，两条链解开，然后使引物模板退火，二者碱基配对，DNA聚合酶随即以4种dNTP为底物，在引物的引导下合成与模板互补的DNA新链。重复此过程，DNA以指数方式扩增。扩增的公式为:Y=(1+X)n 式中