实验报告细胞骨架的荧光观察.pdfVIP

细胞生物学实验报告 实验三 细胞骨架的荧光染色 1 引言 实验目的 1. 了解荧光探针的基本知识 2．学习荧光显微镜的工作原理及使用方法 3. 掌握细胞核和微丝骨架的标记技术 实验原理 细胞骨架：细胞骨架是真核细胞中由蛋白质聚合而成的三维的纤维状网架体系。细胞骨架包括微丝、 微管和中间纤维。细胞骨架在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用。 鬼笔环肽是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反 , 只与聚合的微丝结合 , 而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后 , 抑制了微丝的解体 , 因而破坏了微丝的聚合和解聚 的动态平衡。 Hoechst33342 是一种亲脂性物质，能与 DNA特异性结合的荧光探针，所以被大量用于活细胞 的观察和定量的研究。荧光激发和发射波长分别为 350nm和461nm。 2 实验仪器、试剂及操作步骤 实验仪器 荧光显微镜、载玻片、盖片、滴管、滤纸、 35mm细胞培养皿（六孔板）、湿盒 实验试剂 PEM缓冲液、 % Triton X-100 、4%多聚甲醛、储存液 :1mg/mL( 溶于 PBS) 55nM Alex-phalloidin （鬼笔环肽） 实验材料 鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞 实验步骤 1. 将原代培养的成纤维细胞放于于小盖玻片上，在含 10%胎牛血清的 DMEM培养基中于 37℃,5%CO2培养箱 中培养至细胞融合度达 70%～80%。 2. 取出培养有细胞的小盖玻片，置于小平皿中用 37℃预温 PEM轻轻漂洗 3次。 3. 加入 37℃预温 4%多聚甲醛固定 15min 。 4. 用37℃预温 PEM漂洗 3次。 5. 加入 % Triton X-100 通透处理约 10min 。 6. 用37℃预温 PEM漂洗 3次。 7. 取一个洁净的载玻片，按照载玻片的大小在其上放置一条封口膜，在封口膜上上滴加 10ul 55nM Alexa-568-phalloidin ( 绿 ) ，将经上述处理的盖玻片细胞面向下孵育于染色液中，于湿盒中室温避光 染色 30min 。 8. 小心取下盖玻片，将其置于小平皿中（细胞生长的面朝上），用 37℃预温 PEM避光漂洗 3次。 9. 在载玻片上分别滴加工作液 10ul ，将盖玻片上的细胞倒扣在载玻片上室温暗处孵育 10 min 。 10. 封片。 11. 荧光显微镜观察微丝（蓝色荧光激发，产生绿色荧光）；核（紫外光激发，产生蓝色荧光）。 3 结果与分析 细胞骨架染色结果 图 1 鸡胚成纤维细胞骨架染色时在荧光显微镜下的状态 图注：细胞为鸡胚成纤维细胞，进行爬片培养后骨架染色，细胞染色结果较好，数目较多，但是该视野下 细胞较乱，没有完整拍出细胞骨架。图中细胞为同组同学林诗颖骨架染色的细胞。 结果分析： 如图 1所示，细胞染色结果很好，但使用荧光显微镜时亮度可能没有调好，中间细胞核亮度太 高导致出现光斑，不能清晰观察。细胞生长状况较好。