实验二 质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳检测.pptxVIP

实验二 质粒的酶切和琼脂糖凝胶电泳(diàn yǒnɡ)检测;实验二 质粒的酶切和 琼脂糖凝胶电泳检测 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果(jiē guǒ)及讨论 ;一、实验(shíyàn)目的 ;二、实验(shíyàn)原理 ;琼脂糖凝胶电泳(diàn yǒnɡ)对DNA分子的检测，主要基于在凝胶中加入溴化乙锭，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光，而在紫外光下DNA发出的荧光是可见光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，因而DNA的检测很方便。如将已知大小和浓度的标准样品（Marker）作电泳(diàn yǒnɡ)对照，就可估计出待测样品的大小和浓度。;三、实验仪器、材料(cáiliào)与试剂 ;材料 实验一中提取(tíqǔ)的质粒DNA和本实验酶切后的质粒DNA。 试剂 1. 限制性内切酶 EcoR I，HindIII(XholI) 2. 50×TAE电泳缓冲液（pH8.0）: Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 100ml 稀释到电泳缓冲液1×TAE ;3. 溴化乙锭溶液(róngyè) :10mg/ml水溶液(róngyè)，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。 4. 10×(6×) ×DNA样品上样缓冲液 (Loading Buffer,溴酚蓝指示剂, DNA样品加样缓冲液) 5. 琼脂糖Agarose;四、 实验步骤(bùzhòu) 在20μL反应体系中，包括： 质粒KS 16 μL EcoR I 1μL Xhol I 1 μL Buffer H 2μL ddH2O 0μL 37℃酶切1.5~2.0 小时。 ;或在20μL反应(fǎnyìng)体系中，包括： 质粒pMD18-T 16 μL EcoR I 1μL HindIII 1 μL Buffer M 2μL ddH2O 0μL 37℃酶切1.5~2.0 小时。 ;注：双酶切体系。最初我们 PCR使用(shǐyòng)的PMD18-T(KS)载体特点：600bp外源基因片段的两端分别被EcoR I 和HindIII(Xho I) 酶切，插入PMD18-T(KS )载体MCS多克隆位点，因而可进行EcoR I 和HindIII(Xho I)双酶切验证。双酶切得到的小的外源片段大小应是600bp左右。; pMD18-T Vector;;pBC SK map ;琼脂糖凝胶制备(zhìbèi)步骤;5.待Agrose琼脂糖凝胶液稍凉（约55℃左右，不烫手）后，加入 约1/1000的1 mg/ml溴化乙锭溶液（约4 μL至终浓度为0.5-1 μg/ml）后轻轻混匀，倒入制胶槽上，勿起气泡（避免剧烈摇晃产生气泡）； 6. 室温下约30分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心(xiǎo xīn)垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中； 7. 加入电泳缓冲液（1×TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm； 8. 在DNA样品中加入2μL (1/10体积)的10× DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底； ;使用(shǐyòng)3 mg的DNA Marker DL　2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。;9. 用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中； 10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至100V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现(chūxiàn)； 11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（或电流）回零，关闭电源，停止电泳； 12.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果； 13.根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4℃保存，以备下周实验用。 ;五、实验(shíyàn)结果及讨论;;;;;内容(nèiróng)总结