一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒发明专利.docxVIP

一步法可视化检测新型冠状病毒核酸的引物组和试剂盒 技术领域 本发明属于新型冠状病毒检测技术领域，尤其涉及一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒。 背景技术 新型冠状病毒的检测方法主要包含核酸检测、抗体检测、抗原检测几种方法。抗原检测检出率较低；抗体检测操作便捷、检测迅速，可作为核酸诊断的补充手段，但由于抗体检测“假阳性”和“假阴性”的局限性，不适合用于复工复产复学等普通人群筛查，也不适用于在低流行地区的流行病学调查。核酸检测目前是新型冠状病毒检测的“金标准”，具有早期诊断、灵敏度和特异性高等特点，能够检测到处于窗口期的患者并及早发现感染者。 新型冠状病毒(2019-nCoV)在分类学上属于冠状病毒属中的β类型冠状病毒，具有囊膜和刺突细胞学特征，基因组为线性单股正链的 RNA((+)ssRNA)病毒。病毒中特异性RNA序列是区分该病毒与其它病原体的标志物，新型冠状病毒常用的核酸诊断方法有两种：病毒核酸特异基因检测和病毒基因组测序。最常见的检测新型冠状病毒特异性核酸序列的方法是荧光定量PCR(聚合酶链式反应)，由于新型冠状病毒是RNA病毒，试剂盒检测基本都采用反转录加实时聚合酶链式反应法(RT-PCR)，扩增病原体的核酸(RNA)，同时通过荧光探针实时检测扩增产物，但该技术对检测设备或平台要求较高，高灵敏度的RT-PCR仪价格昂贵，对实验室的洁净度和操作人员要求也较高。此外，核酸检测耗时较长，考虑到样本运输、样本积压的情况，通常最快24小时才可以报告结果。 2000年日本学者Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术，即环介导等温扩增技术，英文名称为“Loop-mediatedisothermal amplification”，受到了世卫组织 WHO、各国学者和相关政府部门的关注，该技术的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，环介导等温扩增反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。 环介导等温扩增虽然存在诸多检测优势，但与逆转录技术联用检测RNA病毒时(如新型冠状病毒)，仍然存在检测时间长、污染风险增大、操作流程复杂性等技术缺陷，导致在实际应用中还存在一定的局限性。 针对机场、海关等特定场所现场检验的需求，发展具有快速、不需要大型仪器、操作简单的可视化快速新型冠状病毒核酸检测技术将带来极大的经济效益及社会效益。 发明内容 有鉴于此，本发明的目的在于提供一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组和试剂盒；本发明所述引物组以新型冠状病毒2019-nCoV 的N基因为模板设计获得，具有特异性高的优点；本发明所述引物组及方法在检测的过程中，可以省略核酸提取步骤，鼻/咽拭子浸泡于灭活型病毒保存液并直接用于检测，病毒RNA扩增后反应溶液颜色发生改变，通过肉眼观察即可判别样本中是否含有目标病毒分子，从而实现对新型冠状病毒2019-nCoV核酸的快速可视化检测。 为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案： 本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括 F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1；所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、 FL-1和BL-1的核苷酸序列分别如SEQ IDNo.1～SEQ ID No.6所示。 本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的试剂盒，包括所述的引物组和检测试剂，所述检测试剂包括酶检测混合液、盐酸胍和 pH指示剂；所述酶检测混合液中包括Taq SSB。 优选的，所述Taq SSB的使用浓度为2～4ng/μL。 优选的，所述酶检测混合液还包括30～50mmol/L的Tris-HCl、 15～25mmol/L的(NH?4)?2SO?4、90～110mmol/L的KCl、14～25mmol/L的 MgSO?4、体积百分含量为0.1％～0.3％的Tween 20，2.5～3.0mmol/L的 dNTP、1.3～1.5mmol/L的dUTP、16～30U DNA聚合酶、15～30U的反转录酶和10～30U重组尿嘧啶-DNA糖基化酶。 优选的，所述盐酸胍的使用浓度为30～60mmol/L。 优选的，所述试剂盒还包括灭活型病毒保存液。 优选的，所述F3、B3、FIP-1、BIP-1、FL-1和BL-1的使用浓度分别为1.5～2.5μmol/L、1.5～2.5μmol/L、15～17μmol/L、15～17μmol/L、 0.3～0.5μmol/L和0.3～0.5μmol/L。 本发明提供了一步法可视化检测新型冠状病毒的引物组，包括 F3、B3、FIP-2、BIP-2、FL-2和BL-2；所述F3