一种表达人源ACE2的动物模型及其用途发明专利.docxVIP

一种表达人源ACE2的动物模型及其用途 技术领域 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种表达人源ACE2(血管紧张素转化酶2)的动物模型及其用途。 背景技术 新型冠状肺炎COVID-19在世界范围内形成大流行，弄清楚其病毒感染机制、研发治疗性药物和疫苗等工作极为重要和紧迫。 SARS-COV-2新型冠状病毒突刺(Spike)糖蛋白通过结合人体内细胞人血管紧张素转化酶2(ACE2)受体入侵机体。 但新冠肺炎病毒研究面临的重大关键难题是缺乏理想的动物模型。虽然非人灵长类动物(如猴子)更接近人类，但由于其价格高、试验周期长、操作不便等问题，并不是动物模型的理想选择。 小鼠是潜在的理想动物模型，但其不易感染SARS-CoV-2，因此需要构建专门的人源ACE2转基因小鼠。 传统的转基因小鼠制备技术是DNA原核显微注射和胚胎干细胞囊胚显微注射法。采用传统的方式进行人源ACE2小鼠的制备需要采用构建ACE2的质粒载体转导后通过供体繁育筛选纯合子F0代从而建立转基因小鼠品系。其缺点是筛选周期长、繁育周期长、随机整合容易表型不稳定、表型的组织特异性不明显。 排除以上弊端之外，传统的动物模型如非人灵长类动物、传统转基因动物在造模过程中存在冠状病毒攻毒后症状轻微不明显等问题，很难实现新冠肺炎重症或者危重症模型的造模。 发明内容 本发明的目的在于提供一种表达人源ACE2(血管紧张素转化酶2)的动物模型及其用途，该动物模型对SARS-COV-2易感，并可以感染SARS-CoV-2，从而实现新型冠状病毒肺炎动物病理模型的造模，并可用于对相关疫苗免疫效果的评估。 本发明的目的通过下述技术方案实现： 一种表达人源ACE2的动物模型，由以下步骤制得： (1)将小鼠ACE2基因信号肽序列和人源ACE2基因(hACE2)成熟肽序列合并并经过密码子优化，然后进一步合成克隆载体；设计引物，以克隆载体为模板扩增hACE2序列； 所述合并并经过密码子优化后的序列如SEQ.ID.NO.1所示； 所述引物的序列如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示； (2)酶切腺相关病毒载体，获取线性化载体骨架，然后与hACE2序列进行同源重组反应，经转化大肠杆菌获得pAAV-hACE2； 所述的腺相关病毒载体优选pAAV-GFP，使用AgeI、EcoRI酶切； (3)辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2三质粒共转染293T细胞，并通过梯度密度超速离心纯化制备，获取重组腺相关病毒AAV-hACE2； 步骤(3)中，辅助性质粒pHelper、血清型质粒pRep2Cap9、目的基因骨架表达载体pAAV-hACE2的比例优选1:1:2； (4)小鼠肺部插管喷射重组腺相关病毒AAV-hACE2，至少2周之后，获得肺和脑组织高表达人源ACE2的小鼠模型； 步骤(4)中，肺部插管喷射的注射量优选100μL，重组腺相关病毒AAV-h ACE2的浓度为1×10?10vg/μL； 所述的小鼠优选6-8周龄小鼠。 本发明的表达人源ACE2的动物模型可以用于新型冠状肺炎(COVID-19)病理模型的造模中； 具体地，是将SARS-Cov-2病毒对动物模型做滴鼻感染，获得新型冠状肺炎(COVID-19)病理模型；优选地，病毒浓度优选1×10?5PFU。 本发明的表达人源ACE2的动物模型还可以用于评估新型冠状肺炎(COVI D-19)疫苗的免疫效果； 具体地，对本发明的动物模型采用肌肉注射或鼻腔接种新型冠状肺炎(CO VID-19)疫苗，然后测定模型动物的体重、检测模型动物体内的病毒载量和中和抗体水平，评估疫苗的免疫效果。 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果： 1、本发明在构建新型冠状肺炎病毒易感小鼠模型的建模速度上比较快，只需要两周即可建模成功，并确定了建模所采用的建模试剂和给药方式、给药剂量，可规模化、标准化地建模。 2、本发明充分揭示了AAV-hACE2小鼠在感染新型冠病毒后的病理特征，和在新型冠状病毒疫苗上的应用，从而明确了该模型适用于新型冠状病毒疫苗药效学评价。 附图说明 图1是重组腺相关病毒AAV-hACE2对小鼠各组织人源ACE2表达量影响的WesternBlot结果。 图2是重组腺相关病毒AAV-hACE2对小鼠各组织人源ACE2表达量影响的免疫组化结果。 图3是不同给药方式对小鼠肺部组织表达人源ACE2的影响。 图4是模型小鼠感染SARS-Cov-2后体重变化和中体抗体水平；其中，A-体重变化，B-中体抗体水平。 图5是模型小鼠感染SARS-Cov-2后有关基因表达量的变化及肺组织病毒滴度检测结果；A-基因表达量变化，B-病毒滴度检测结果。 图6是模型小鼠感染SARS-Cov-2后细胞因子转录水平检测结果。 图7是模型小