偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用发明专利.docxVIP

偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用 技术领域 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用。 背景技术 新型冠状病毒SARS-CoV-2可导致人类病毒性肺炎或肺部感染，与2002年的SARS冠状病毒和2012年的MERS冠状病毒同属于β冠状病毒属。新型冠状病毒由膜表面的四种糖蛋白（棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核蛋白）以及RNA核酸链组成，其中棘突蛋白（SpikeGlycoprotein）担负新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，通过结合人的血管紧张素转换酶2（ACE2），从而介导病毒膜和细胞膜的融合，感染人的呼吸道上皮细胞，与病毒的传染能力相关，是新冠病毒最重要的表面膜蛋白。棘突蛋白含有S1与S2两个亚基，S1主要包含有受体结合区（Receptor binding domain，RBD），负责识别细胞的受体，S2则含有膜融合过程所需的基本元件，促进病毒细胞融合。 开发新的抗新型冠状病毒S2蛋白抗体并构建快速高效的抗体筛选技术，将为新型冠状病毒的诊断和治疗提供有力工具。 发明内容 本发明的目的是提供偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠及其制备方法与应用。 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠，所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠是将表面修饰有链霉亲和素（SA）的磁珠与生物素（Biotin）标记的新型冠状病毒S2蛋白（生物素化的S2蛋白）结合制得的 其中，新型冠状病毒S2蛋白包含如下的氨基酸序列或由其组成： i）如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或 ii）在i）的N端和/或C端连接标签得到的氨基酸序列；或 iii）i）或ii）的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。 蛋白偶联到磁珠的方式多种多样，可以通过羧基或氨基共价偶联的方式，直接将蛋白共价偶联到磁珠上，也可以通过标签抗体，将带有标签的蛋白偶联到磁珠上，在进行抗体捕获时，由于抗原蛋白的结合位点通常不止一个，因此用抗原去筛选出不同表位的抗体，需要抗原的结合表位能够全部暴露出来，通过羧基或氨基共价偶联到磁珠表面的抗原，都存在部分结合位点暴露不充分的可能性，而通过标签抗体偶联的抗原蛋白，则要求标签抗体和抗原蛋白间能很牢固结合在一起，也即需要高亲和力。由于SA和Biotin的解离常数在10?-14M数量级，一旦结合往往是不可逆的强结合，因此链霉亲和素（SA）偶联的磁珠去结合生物素（Biotin）标记的抗原蛋白会更牢固，且抗原蛋白的结合位点也能更好地暴露出来。 优选地，磁珠的平均粒径大小为1-5μm左右，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面，每mg磁珠偶联500-2000pmol链霉亲和素；所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为500-2000pmol/mg磁珠。 更优选地，磁珠的平均粒径大小为2μm左右，链霉亲和素共价偶联于磁珠表面，每mg磁珠偶联1000pmol链霉亲和素；所述表面修饰有链霉亲和素的磁珠可结合游离生物素的量为1000pmol/mg磁珠。 所述生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白中，生物素与新型冠状病毒S2蛋白的摩尔比为0.5-1:1。 本发明中使用的S2蛋白的生物素标记度大于0.5，检测生物素标记度使用的是HABA检测试剂盒（Thermo Fisher，Cat. No. 28005）。 所述新型冠状病毒S2蛋白是通过Avi酶定点标记生物素的蛋白，分子量为61.5KDa，通过生物素与SA不可逆地强结合方式，定向偶联到修饰有SA的磁珠上。 所述偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠中新型冠状病毒S2蛋白的含量为30-60μg/mg磁珠（初始偶联量为60μg/mg磁珠）。 本发明中，表面修饰有链霉亲和素的磁珠，即链霉亲和素磁珠购自Acrobiosystems，Cat. No. SMB-B01。 第二方面，本发明提供偶联新型冠状病毒S2蛋白的磁珠的制备方法，包括以下步骤： （1）将表面修饰有链霉亲和素的磁珠，用缓冲液洗涤3-5次；用磁性分离器进行分离，弃上清； （2）加入生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，室温混合孵育； （3）孵育结束后，用磁性分离器分离反应后的磁珠，弃上清，用缓冲液洗涤3-5次。 前述的方法，步骤（1）包括：取1mg表面修饰有链霉亲和素的磁珠，加入1mL洗涤液混匀，将体系置于磁性分离器上2-3分钟，使磁珠完全被磁性分离器吸附住，弃上清，重复洗涤2次。 其中，所述洗涤液为PBST液（PBST缓冲液），其成分为含0.01-0.1%（优选0.05%）吐温20的0.01M PBS液。 步骤（2）包括：向洗涤后的磁珠中加入1mL用PBST液稀释到60μg/mL的生物素标记的新型冠状病毒S2蛋白，涡旋混匀，于室温孵育0.5-2小时（优选1小时）