利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法发明专利.docxVIP

利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法 技术领域 本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法。 背景技术 新型冠状病毒(即SARS-CoV-2，或称为COVID-19)是2020年在全球大规模爆发的冠状病毒新毒株，与SARS冠状病毒同为β属冠状病毒。人感染了新型冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡，对人类健康造成严重威胁。 新型冠状病毒核衣壳蛋白（N蛋白）是新冠病毒衣壳内最重要的结构蛋白之一，在病毒的结构蛋白中所占比例最大。COVID-19-N蛋白与病毒基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA的合成过程中发挥着重要的作用。N蛋白在新冠病毒中相对保守，感染早期机体就能产生抗N蛋白的高水平抗体，因此，N蛋白具有建立快速检测新型冠状病毒血清抗体方法的潜力，也可以进一步开展单抗制备等研究，市面上的冠状病毒N蛋白多采用大肠杆菌原核表达系统进行表达。原核表达的优点在于能够短时间内获得基因表达产物，成本相对较低，方法也比较简单。但由于大肠杆菌原核表达系统与真核表达系统相比，存在蛋白折叠错误及翻译后修饰等诸多缺陷，使用大肠杆菌表达制备的N蛋白存在与新冠病毒感染人体后人体细胞所表达的N蛋白结构及修饰不同的风险，进而降低了免疫诊断和抗体制备的准确性。 发明内容 本发明的目的是提供一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法。 为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种利用HEK293细胞制备新型冠状病毒核衣壳蛋白的方法，包括以下步骤： 1）构建新型冠状病毒核衣壳蛋白重组表达载体； 2）用步骤1）中构建的重组表达载体转染HEK293细胞； 3）体外培养细胞，采用一步亲和层析法从培养上清中分离纯化重组表达的新型冠状病毒核衣壳蛋白。 前述的方法，步骤1）中新型冠状病毒核衣壳蛋白重组表达载体的构建方法包括：在新型冠状病毒核衣壳蛋白的N端引入如SEQ ID NO:2所示的前导肽，并在新型冠状病毒核衣壳蛋白的C端引入用于蛋白纯化的标签（如6×His标签），人工合成上述重组蛋白对应的核酸构建体，并将其构建到真核表达载体上。 进一步地，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 进一步地，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。 所述真核表达载体采用的启动子可以是EF-1α（human elongation factor-1α）启动子、hCMV（human cytomegalovirus）启动子或SV40（Simian vacuolating virus40）晚期启动子等。 其中，所述启动子与所述核酸构建体可操作地连接。 所述真核表达载体为pcDNA3.1(+)。 前述的方法，步骤2）包括：将HEK293细胞培养至细胞密度为1.8-2.2×10?6个/mL（优选2×10?6个/mL），活率95%以上；将所述重组表达载体与PEI转染试剂混合后加入HEK293细胞中。 优选地，1×10?6个细胞对应于1 ug质粒；所述重组表达载体与PEI转染试剂的质量比为1:3。 前述的方法，步骤3）中HEK293细胞的培养条件为：37℃，5%CO?2，130-200 rpm（优选135rpm）培养96 h。 所用细胞培养基可以是CD 293 TGE培养基。 前述的方法，步骤3）中采用His-tag亲和层析柱对重组蛋白进行分离纯化，包括：1000g离心30 min收集细胞培养上清，将上清过滤后加至预先用PBS缓冲液平衡的GEHisTrap excel层析柱，然后依次用含有0、30、100、250和500 mM咪唑的PBS缓冲液进行梯度洗脱，每个浓度洗脱体积为10 CV，收集蛋白洗脱液。并进行SDS分析。根据SDS结果，100、250、500 mM咪唑条件下洗脱得到的N蛋白纯度均高达95%以上，将该部分蛋白混合后进行透析，所用透析袋的截留分子量为30KDa。于4℃冰箱中透析过夜，所用透析液为：PBS缓冲液（pH7.4）。并对透析后的样品进行SDS检测。 第二方面，本发明提供按照上述方法制备的新型冠状病毒核衣壳蛋白的以下任一应用： （1）用于制备新型冠状病毒疫苗； （2）用于制备新型冠状病毒抗体检测试剂。 与现有技术相比，本发明至少具有以下优点： （一）本发明利用HEK293表达系统可在短时间内获得大量新冠病毒核衣壳蛋白，纯度高达98%以上，表达量高达300mg/L。 （二）与使用大肠杆菌表达系统制备的核衣壳蛋白相比，采用HEK293表达系统制备的新冠核衣壳蛋白在与抗体的结合活性以及新冠抗体的胶体金检测方面均表现出极大优势，且HEK293表达系统制备的新冠核衣壳蛋白其蛋白空间构象