分子克隆技术第一部分.pptVIP

EB：溴化乙锭，可嵌入DNA分子中，受紫外光激发而发出荧光，利用它可检测DNA。是诱变剂，可引起插入突变，并有中度毒性，操作时应注意防护。操作时应戴手套，尽量减少台面污染。1000×贮存液(0.5mg/mL )，使用时按1：1000稀释配制染色液。 第三十一页，共83页 质粒电泳检测： 一般有一至三条带（质粒DNA的三种构型） 超螺旋 线型 开环 第三十二页，共83页 质粒电泳检测 第三十三页，共83页 本科生试验图片 第三十四页，共83页 质粒载体的抽提，外源DNA的准备 琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量 亚克隆载体与外源DNA的限制性内切酶消化 (目的片段的回收，亚克隆载体的去磷酸化) 载体与外源DNA的连接 感受态细胞的制备 连接子转化感受态细胞 重组子的转化及筛选、鉴定 利用质粒克隆外源DNA片段的主要步骤 第三十五页，共83页 外源DNA 克隆的要求 特点 不同的突出端 用两种限制酶消化后需纯化质粒以提高连接效率 一般酶切位点可保留, 非重组克隆背景低 不需CIP处理 外源DNA只以一个方向插入重组质粒中 相同的突出端 线状质粒DNA常需用磷酸酶（CIP）处理 一般酶切位点常可保留 外源DNA会以两个方向插入 重组质粒可带有外源DNA的串联拷贝 末端为平端 要求较高的DNA及连接酶 不同酶切的平头可连接 非重组克隆的背景高 质粒及外源DNA连接处的酶切位点消失（不同