高中生物竞赛：蛋白质的结构与功能课件.pptVIP

凝胶电泳示意图 * 几种重要的蛋白质电泳 *SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量的测定。 *等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。 *双向凝胶电泳是蛋白质组学研究的重要技术。 * 电泳法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） SDS能与各种蛋白质形成蛋白质-SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。 SDS能使蛋白质完全变性。有几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链（还原条件下），因此测定的结果只是单条肽链的分子量。 目的：消除净电荷对迁移率的影响 * SDSSDS分为还原（其中用巯基乙醇处理，链内和链间二硫键打开）和非还原（不用巯基乙醇处理，链内和链间二硫键保留） * 1 * SDS考马斯亮蓝或其他适宜的方法染色，显示的蛋白条带分子大小 * 1 * 1 （四）层析 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质（固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 * 蛋白质分离常用的层析方法 * 离子交换层析：利用各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 * 凝胶过滤(gel filtration)又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同分离。 * 目 录 * 凝胶色谱分离蛋白质的原理 * 1 例如： 1、假设用分子筛层析等方法，测定天然蛋质白Mr=120,000 SDS（非还原条件下）测得Mr=60,000; SDS（还原条件下）测得Mr=30,000; Mr=60,000 Mr=3,0000 结论：此蛋白质可能由相同的4条多肽链（2个Subunit，亚基之间含二硫键）组成 * 1 例如： 2、假设用分子筛层析等方法，测定天然蛋质白Mr=120,000 SDS（非还原条件下）测得Mr=70,000和 50,000（2条蛋白带） SDS（还原条件下）测得Mr= 70,000和 50,000（2条蛋白带） Mr=70,000 Mr=50,000 结论：此蛋白质由Mr不相同的2条多肽链（two Subunits）组成( subunit之间不含二硫键) * 1 生物化学 常用的配基有抗体、抗原、激素或受体蛋白、酶的底物和抑制剂等。层析柱载体为琼脂糖凝胶等。 ? 这是一种高效分离纯化蛋白的方法。其原理是不同的蛋白质分子对于固定在载体上的特殊配基具有不同的识别和结合能力。 亲和层析法 * （五）超速离心 * 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。 *蛋白质在离心场中的行为用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示,沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 * 因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 * 蛋白质的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 * 等电聚焦电泳 * 蛋白质的双向电泳 * Western印迹 * 三、多肽链中氨基酸序列分析 分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成 测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 测定各肽段的氨基酸排列顺序，一般采用Edman降解法 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 * 生物化学 基因发生 突变 关键氨基酸 发生变化 蛋白突变 导致 (分 子病) ? 发病机理 ? 概念 由蛋白质分子发生变异所导致的疾病，称为“分子病” 分子病的发病机理及概念 * 生物化学 细胞色素C (Cytochrome C) 线粒体 （Mitochondron） （二）蛋白质的一级结构相似，功能相似 同源蛋白质（Homologous protein）: 指存在于不同物种，功能相同，在进化上相关的一组蛋白质。 * 生物化学 不同物种细胞色素C氨基酸序列比对图 不同物种细胞色素C关键部位相同，在进化上是保守的 * 生物化学 不同生物与人的Cytc的AA差异数目 生物 与人不同的AA数目 根据细胞色素 C的 顺序种属差异建立 圆圈代表分歧点 All right by Shunqin Zhu 起来的进化树 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊、狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角饺 23 小蝇 25 蛾