小孢子培养技术.docVIP

小孢子培养技术 4.2 小孢子培养技术 4.2.1小孢子培养步骤 4.2.1.1选蕾 :一般选择在天气晴朗的正午8:00-10:00之间取材，尽量选取主花序或生 长状态较好的花序，然后在实验室选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾备用。 注释: ?、 如果遇到阴雨天气，为了不影响实验进程也可以取材，但一定要选取生长良好的花序，因为有研究报道低温有利于小孢子的胚胎发生。 ?、甘蓝型油菜花序一般选取大小在2.5~3.5mm之间的花蕾，但是不同的油菜品种花蕾的发育时期不尽相同，可以剥蕾挑取小孢子进行镜检以确定恰当发育时期(最佳时期为单核晚期至二核期)。 ?、取蕾以后如果不能立刻进行小孢子的提取过程的话，应将花蕾放置于湿润的条件下低温保存。 4.2.1.2消毒:选取的花蕾用75%的酒精消毒1min(一般不要超过一分钟)，然后用升汞消毒8-10min, 最后用无菌水清洗3次，每次5 min。 4.2.1.3抽提花粉: ?、将花蕾放置于玻璃管中，加入1-2滴B5液体培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，倒入过滤器过滤，花粉滤液盛入10ml离心管 ?、用滴管吸B5抽提培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2-3次后，在10ml离心管中将花粉悬浮液稀释 ?、将花粉悬浮液离心，800转/min，离心5min ?、将离心管中的上层清液吸去，再加液体B5抽提液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心(用封口膜封口)，800转/min，离心5min，吸去上层清液 4.2.1.4加倍培养: ?、将沉淀的花粉用NLN-16 液体培养基稀释(注:稀释不要超过10ml, 因为加倍完以后还要在10ml的离心管中再次稀释离心)，倒入三角瓶在32?条件下暗培养2天左右(48h -72h之间)。 ?、然后检查是否有污染的现象，如果没有污染，则分皿继续培养。 4.2.1.5胚诱导培养: ?、将加倍后没有污染的NLN-16花粉悬浮液再次倒入离心管中离心，600转/min，离心5min，倒掉NLN-16液体，留下沉淀的花粉。 ?、将沉淀的花粉再次用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入7.5cm培养皿，一般每皿加入悬浮液3ml\左右，每ml含花蕾大约1.5-2个，用封口膜封口。 ?、将封口的培养皿在25?的条件下进行暗培养，大概10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至50rpm、25?恒温摇床上继续进行暗培养。 ?、当暗培养的胚发育至子叶形胚形成时移入B5固体培养基，于20?，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养。 4.2.2再生苗的诱导与培养阶段 4.2.2.1将暗培养获得子叶形胚移入B5固体培养基，于20?，16 hr光/8 hr暗，2000LUX光强条件下培养，进行再生苗的诱导。 4.2.2.2进行再生苗诱导培养的胚一般15天左右换一次培养基进行继代培养，具体的时间依据胚在培养基的中生长状态决定，继代1-2次直至长出再生植株。 4.2.2.3 长出的再生植株继续在B5固体培养基上培养，依据生长状态定期进行继代 4.2.3移栽阶段 获得的再生苗一般在10月中旬开始移栽到大田，移栽时先要洗尽根部的培养基，移栽后立刻浇足定根水，用遮阳网覆盖，一般白天覆盖，晚上打开，直至移栽的再生苗成活，然后按照一般的大田管理进行管理。 附注1:组织培养所用基本培养基母液配方(g/L) B5 MS NLN 大量元素(20X) KNO 50 38 2.5 3 NHNO -- 33 -- 43 CaCl.2HO 3 8.8 -- 22 MgSO.7HO 5 7.4 2.5 42 KHPO -- 3.4 2.5 24 (NH)SO 2.68 -- -- 424 NaHPO.2HO 3.392 -- -- 242 Ca(NO).4HO -- -- 10 322 铁盐(20X) FeSO.7HO 0.556 0.556 0.556 42 Na.EDTA 0.746 0.746 0.746 2 微量元素(200X) KI 0.15 0.166 0.166 HBO 0.6 1.24 1.24 33 MnSO.HO 2 4.46 3.474 42 ZnSO.7HO 0.4 1.72 2.118 42 NaMoO.2HO 0.05 0.05 0.05 242 CuSO.5HO 0.005 0.005 0.005 42 CoCl.6HO 0.005 0.005 0.005 22 有机成分(200X) (1 X) 肌醇 20 20 20 0.1 烟酸 0.2 0.1 1 甘氨酸 -- 0.4 0.4 盐酸硫氨(B) 2 0.02 0.1 1 盐酸吡哆素(B) 0.2 0.1 0.1 6 叶酸 --