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. . 精品 精品 血液样品预处理的标准操作 一、目的 规范色谱分析中血液样品预处理的操作。二、职责 实验室分析测试人员对本规程的实施负责。 对于每一项具体的研究课题，具体的操作步骤应由实验室负责人负责制定，并由实验室分析测试人员严格实施。 实验室负责人负责对本规程的修订。三、血液样品预处理的标准操作 实验仪器与设备的准备 试管 一般采用有盖子和刻度的尖底试管，要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整齐。 EP 管 一般采用的规格有 1ml、1.5ml、2 ml。要求密封性好，编号清楚准确，并摆放整齐。 移液器 要求定量准确，重复性好。 其它 涡流混合器、离心机、真空泵、烧杯、量筒、记号笔、试管架、标签纸等。 样品的均匀化 将装有血浆（血清）样品的 EP 管放置在冰箱冷藏室内，缓慢解冻为血浆（血清）溶液。 然后取出放置至室温，置涡流混合器上混匀或往复振摇亦可到达均匀的目的。 液－液提取 提取溶剂的准备 常用的溶剂有乙酸乙酯，乙醚，环己烷等。 提取溶剂可以是一种也可以是几种溶剂的混合溶液， 目的是调整提取溶液的剂性， 既保证待测样品被充分萃取进入提取溶剂，同时又有很好的选择性。 根据待测样品的需要用移液器（移液枪）定量吸取血浆（血清）至试管中。 必要时调整血浆（血清）溶液的 pH 值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液，然后涡旋混匀。 用移液器定量吸取提取溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。 溶液的混匀 涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡， 并保证样品溶液旋涡充分混匀， 旋涡时间一般为 2-3 分钟。 样品的离心 将试管置于离心机中，分离过程中一般采用 4000r/min 。离心之前注意要平衡，加速时应注意缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为 10 分钟。 离心分离后试管中样品分为上下两层，用移液器吸取上层有机相，转移至另一试管中。 溶剂的挥发 自然挥发 将样品溶液放置在室温下挥发，有时还可适当加热，加速溶液挥发。 氮气吹干 氮气流能防止发生氧化，为了加快挥散速度，将样品溶液置于氮气流下吹干。 减压蒸发 在密闭容器内，通过抽真空以降低液体表面的压力，使其沸点降低，样品溶液很快挥发，减少了蒸发过程中样品与空气的接触，避免由此引起的分解等副反应，适于热不稳定的样品。 样品的复溶 用于样品溶液残渣复溶的溶液通常采用流动相或其它有机溶剂。 用移液器准确定量吸 取，并且复溶样品应充分混合均匀。 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清楚。待样品进样分析以前取出，以保证样品的稳定。 乳化现象 防止乳化 可增加有机溶剂的体积，避免猛烈振摇或加入适当的试剂改变其表面张力等方法防止乳化。 破乳 若已发生严重的乳化现象，应采取适当的方法消除乳化。 离心 可将试管置于离心机中离心消除乳化。 冷冻 可将试管置于冰箱中冷冻消除乳化。 加入电解质。 加入适当的稀释液稀释。 去蛋白处理 有机溶剂的准备 甲醇与乙腈是反相液相色谱法中常用的蛋白沉淀剂， 因为它们与流动相的组成相同。甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清澈，沉淀为絮状易于分离；乙腈与之相反，产生细的蛋白沉淀， 但沉淀效率较甲醇高。 根据待测样品的需要用移液器定量吸取血浆（血清）至试管中，盖好试管塞。 必要时调整血浆（血清）溶液的 pH 值，根据待测样品的性质加入酸、碱或缓冲溶液。 用移液器定量吸取有机溶液至装有血浆（血清）的试管中，盖好试管塞。 溶液的混匀 有机溶剂使蛋白质变性而析出沉淀，从而把与蛋白质结合的药物解离出来。与此同时待测样品大部分被萃取进入有机溶剂。 涡流混匀 将试管置于涡流混合器上进行旋涡，并保证样品溶液旋涡充分混匀，旋涡时间一般为 2-3 分钟。 摇床混匀 将试管置于摇床上往复振摇，振摇时间一般为 5-10 分钟。 离心去除蛋白 将试管置于离心机中， 分离过程中一般采用 3000-4000r/min 。离心之前注意要平衡， 加速时应注意缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为 15-20 分钟。 离心分离后变性蛋白质沉淀于试管底部，用移液器吸取上层有机溶液，转移至另一试管中。 过滤 经过去蛋白处理后的样品溶液用 0.45 μm的滤膜过滤。 高速离心 将过滤后的样品溶液转移至 EP 管中，采用 25000-30000 r/min 。离心之前注意要平衡 ， 加速时应注意缓慢逐步加速，以防加速过快试管炸裂，离心时间一般为 5-10 分钟。 经过以上处理后得到的样品溶液，如果待测物的浓度在定量限以上，而且溶剂对 HPLC 系统没有干扰，就可以直接进样分析。如果需要除去溶剂，即浓缩甚至干燥样品，方法同 3.8-3.9。 预处理样品的储存 预处理后的样品应保存在冰箱冷藏室，样品应竖直放置、排列整齐、编号准确清