2提质粒_XXXX年分子生物学实验.pptxVIP

实 验 一;背景理论知识;掌握质粒信息和用途，学会自己看质粒图谱 掌握快速提取小量质粒DNA的方法 了解质粒DNA提取的基本原理 掌握琼脂糖凝胶电泳的方法;1.1.2 载 体;载体的基本条件;质 粒 载 体;;质粒（原核载体）;1.1.2 载 体;质粒（真核载体）;1.1.3 质粒提取一般步骤;质粒提取的常用方法;碱裂解法提取质粒DNA;[实验原理] 根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。 在pH12.0-12.5，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，质粒DNA的氢键断裂，但两条互补链仍紧密结合。 当加入pH4.8的KAc高盐缓冲液中和pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性慢，缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与RNA、蛋白质-SDS复合物等一起絮状沉淀下来而被除去。;实验操作;1.2.1 实验材料;苯酚：氯仿（25：24） 氯仿：异戊醇(24：1) 无水乙醇， 70%乙醇(-20?C保存) TE缓冲液: 10mmol/L Tris.HCl, 1 mmol/L EDTA(pH8.0) 胰RNA酶 ;1.2.2 实验程序;1、细菌培养和收集 将3ml含Kan的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。（已完成） 取2.5mL培养物倒入微量离心管（EP管）中, 10000rpm离心1min，吸去培养液。;2、细菌裂解及质粒的提取;向上清中加入等体积（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下层是有机相）,反复混匀。 12000rpm,离心2分钟,将上清小心地转移到另一离心管（标记！）中 加入等体积（450ul）氯仿:异戊醇 (24:1),反复混匀。 12000rpm,离心2分钟，取上清液于新的EP管中。;4、质粒的浓缩 加入2倍体积（900ul）无水乙醇,混匀后,室温放置10min。 12000rpm离心5分钟，倒去上清液,把离心管倒扣在吸水纸上,吸干液体。 用1ml 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀, 振荡并离心, 12000rpm离心2分钟，倒去上清液, 空气中干燥5－10min。;5、质粒的溶解和保存 加20ul TE缓冲液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 -20℃保存。;样品保存;6、质粒DNA的电泳检测;（2）琼脂糖凝胶电泳 每人1个样品，pET28a或pEGFP-N3。 取3μl质粒DNA+1.0μl点样缓冲液，在parafilm膜上混匀后全部点至琼脂糖凝胶孔（记住自己点样位置）。 接通电泳仪和??泳槽的电源(注意正负极)（-→+） 恒压150V,电泳10-20分钟 紫外灯下观察并记录结果(对面实验室拍照片) 分析结果。;负极－;实验关键点;移液器（排气式和排液式）;实验要求： 每人提取质粒2份（pET28a和pEGFP-N3各一份） 溶液每大组一套 枪每2人一套 Tips 2人一套（3盒）;思 考 题;下 次 实 验;开始工作吧！LET’S BEGIN NOW！