高效液相色谱分析方法开发.ppt

分析方法开发三步骤 HPLC 分析方法开发 选择合适的色谱柱(固定相)和流动 相，得到合理的保留时间 调整选择性以及各个色谱峰的分离度 调整流速、填料粒径、色谱柱规格(长度及内径)以获得最佳的分离 开发分析方法的规则 合适的保留因子k (k值1-20)是获得满意分离的基础 保留因子 k=(tR-tM)/tM 用以下“秘诀”可以使您的开发过程更加简便、快速 揭秘--------选择合适的起始条件 不同的样品不同的思路 中性化合物无需调整流动相的pH值；而对于含有带电基团的 化合物，则需要用缓冲溶液调整流动相的pH值；有时需要 采用离子对反相色谱 选用通用的色谱柱 一般直接选用C18(或C8) 5um 12.5, 15, 25cm 长的色谱柱 选择流动相 甲醇/水或乙腈/水(依据个人习惯而定) 流动相的调整“秘诀” 秘诀1 由强到弱 一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验， 这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调 整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。 流动相的调整“秘诀” 秘诀2 三倍规则 每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量， 保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是 一个聪明而又省力的办法。调整的过程中， 注意观察各个峰的分离情况。 秘诀3 粗调转微调 当分离达到一定程度，应将有机溶剂 10%的改变量调整为5%，并据此规则 逐渐降低调整率，直至各组分的分离 情况不再改变。 流动相的调整“秘诀” 流动相的调整“秘诀” 秘诀4 更换流动相的组成 在第三步，我们已经基本上得到了一个合适的 保留因子，如果还有一些组分的分离情况不好， 则应考虑更换流动相的组成(如有机溶剂类型的 改变、pH值的改变或是加入离子对试剂，等等)， 或者，索性改变固定相的类型。 色谱柱的调整 根据操作压力、出峰时间、分离度 来调节色谱柱的长度、粒径以及 流动相流速， 从而 获得最佳的分离 最后