核酸扩增技术.pptxVIP

1;大纲要求：;二、教学内容;基础知识;+;基础知识;;;基础知识;融解温度（Tm）定义： 在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。 ;　　　　　DNA复性;基础知识;基础知识; PCR概念：在体外特异地复制一段已知序列的DNA片段的过程。;一、PCR的原理和反应过程;变性（denaturation）;退火（annealing）;延伸（extension）;PCR的基本反应过程;PCR的扩增效率;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ ;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs 缓冲液 ;模板(template);耐热DNA聚合酶;dNTPs;镁离子浓度; 引物(Primer);引物设计时必须遵循的原则（6条）;引物设计时必须遵循的原则;PCR扩增中的退火温度是根据引物的Tm值而决定的，二条引物的Tm值不能差别太大。 根据需要，合成引物时在其5’端可以加修饰成分 如加入酶切位点，用生物素、荧光素、地高辛等标记，引入突变位点，引入启动子序列，引入蛋白质结合DNA序列等。;三、 反应条件;2、时间 ;3、循环次数 ;四、PCR技术的质量控制;（一）实验室的规范化设置;（二）PCR技术的质量保证;（二）PCR技术的质量保证;（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析;第二节;（一）逆转录PCR技术 （二）巢式 （三）定量PCR技术（＊＊＊＊＊） （四）多重PCR技术 （五）PCR诱导定点突变 （六）原位PCR技术 （七）差异显示PCR技术 （X）免疫PCR技术 ;（一）、逆转录PCR;（二）、巢式PCR;（二）、巢式PCR;（三）、定量PCR;（四）多重PCR技术;（四）多重PCR技术;（四）多重PCR技术;（四）多重PCR技术;（五）PCR诱导定点突变;（六）原位PCR技术（in situ PCR）;（六）原位PCR技术（in situ PCR）;（六）原位杂交PCR;（七）差异显示PCR（defferential display PCR,DD-PCR）;;（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）;（X）免疫PCR（Immuno-PCR,IPCR）;;（X）免疫PCR（immuno-PCR,IPCR）;第三节;第三节 PCR产物的检测;一、PCR—限制性片段长度多态性;;;;RFLP的优缺点;二、等位基因特异性寡核苷酸;;;;;ASO的优缺点;三、单链构象多态性;三、单链构象多态性;四、变性梯度凝胶电泳;;;变性梯度凝胶电泳的优缺点;Tm值的大小取决于DNA分子的长度和其序列中的G/C含量 双链DNA可以结合荧光染料（SYBR Green I） DNA复性时，荧光最强，随温度上升，荧光变弱，形成融点曲线。 正常序列和突变序列因不同Tm而产生不同的融点曲线。 ;;;优点： PCR产物不需要纯化，可以直接分析 可以进行大批量样本分析，成本低 结果重复性可达100% 缺点： 不能确定突变的位置;PCR产物的序列分析主要用于 分子克隆时对于目的基因扩增片段的序列鉴定 对致病基因检测时分析扩增片段中点突变的位置和性质。;DNA自动测序 ;DNA自动测序结果举例;PCR产物序列分析的优缺点;PCR产物分析方法的比较;拓展：PCR技术在分子诊断中的应用;目前分子诊断最常见的应用：;两个对照组;诊断策略 ;间接诊断策略的遗传标记;（1）限制性片段长度多态性  （PCR-RFLP);;;2）可变数目串联重复和短串联重复（STR）;;作业;感谢您的观看。