基因工程菌培养.ppt

基因工程菌培养 什么是基因工程菌？ 为什么要构建基因工程菌？ 遗传性状的改良 代谢途径的加工 生物反应器 基因工程菌的构建 宿主菌：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,遗传背景清楚,技术操作简单,培养条件简单,大规模发酵经济, 是应用最广泛,最成功的表达体系 外源基因：质粒 基因工程菌生长的特点： 外源基因与宿主的互相影响 产物，资源的争夺 基因工程菌与普通微生物发酵有什么区别？ 微生物发酵主要收获的是它们的初级或次级代谢产物，细胞生长并非主要目标。 基因工程菌培养是为了获得最大量的基因表达产物。这类物质是相对独立于细胞染色体之外的重组质粒上的外源基因所合成的、细胞并不需要的蛋白质。 基因工程菌发酵的设备 气升式发酵罐的优点： 结构简单，不易污染，能耗低，操作简单，低剪切力, 适合高浓度发酵。 基因工程菌往往对剪切力更为敏感（why？） 基因工程菌的高密度发酵 在基因工程菌的发酵中，菌体的增殖和产物的表达都是在对数期内完成的，因此，发酵工艺的改进就集中在如何延长工程菌的对数生长时间，缩短衰亡时间 高密度发酵工艺是基因工程菌发酵的主要生产工艺 高密度发酵 培养基的要求 高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要。 成分的要求：使用甘油的原因？ 浓度的要求 在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高 。 比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍 培养方式 分批补料培养方式 补充营养 稀释代谢产物 分离与培养耦合 固定化培养技术 固定化技术与连续培养，透析培养相结合是基因工程菌发酵的发展方向 接种量的控制 接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快。 接种量过小，延迟期太长 较接种量大，可缩短生长延迟期，菌体迅速繁衍，很快进入对数生长期，适于表达外源基因。 接种量过高，使菌体生长过快，代谢物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 发酵中溶解氧的控制 纯氧？富氧！ 添加提高传氧能力的VHb蛋白，添加H2O2，血红蛋白，小球藻。 溶氧过高或局部过高，会使某些微生物氧中毒 pH值的控制 在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。 常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。 培养温度 高温提高生长速度 低温增加重组菌稳定性 对于温度敏感重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。 诱导剂及诱导时间控制 乳糖操纵子，IPTG 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。 基因工程菌的不稳定性及对策 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性： 结构不稳定性 重组 DNA 分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，降解导致其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组 DNA 分子从受体细胞中丢失。 质粒拷贝数的影响 质粒的拷贝数的影响 外源蛋白的合成速率取决于质粒拷贝数，在高拷贝数下，结构物质如氨基酸的供应成为限制因素，导致细胞的代谢活力下降，高生长数率时质粒拷贝数下降，但稳定性增加。 基因工程菌的遗传不稳定性的的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组 DNA 分子的降解 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 影响质粒稳定的因素 与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响 宿主对质粒稳定的影响 质粒拷贝数 重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 培养条件的影响（培养基，温度，pH等等） 稳定基因工程菌的措施 改进重组质粒的结构 选择