染色质免疫沉淀.pptxVIP

1;基因型决定表型;破坏了基因型也就改变了表型;但是，也有一些无法解释的现象 ;什么是表观遗传学?;表观遗传修饰;染色质重塑;染色质免疫沉淀技术的发展使染色质重塑研究得以进步;实验目的;实验原理;实验流程; 甲醛的作用 在各种交联试剂中，甲醛（HCHO）的应用最为广泛。甲醛的浓度、作用时间及交联的温度等均可能影响交联的程度。甲醛可以通过赖氨酸、精氨酸和组氨酸以及那些DNA的氨基和亚氨基基团之间的交联，高效地在体内交联蛋白质-DNA、蛋白质-RNA以及蛋白质-蛋白质，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。除此之外，HCHO可以忠实地保留染色质结构，而且在温和条件下交联很容易逆转。通常交联所用的甲醛终浓度为1%，在12-37℃作用30min。但是如果反应温度超过30℃，本底就可能增加。因此，当必须在高温进行交联时，则应减少作用时间或甲醛浓度。过度交联将??响细胞的裂解，并且在超声处理时不能获得理想长度的DNA片段及影响DNA的溶解。对于特别容易进行交联的目的蛋白质（例如，组蛋白）需减少交联时间或甲醛浓度。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。;细胞的用量 通常2.5×108细胞足够进行4次免疫沉淀。因此，一般为了保证用量，采取培养多瓶细胞，胰酶消化，收集在50ml离心管中，培养液重悬，计数。（一般分装1х107细胞于一个EP管，用于免疫沉淀反应）。 交联条件对实验结果的影响 对于不同的细胞类型，甲醛的浓度、交联的长度或者交联的温度都需要调整。如果交联不充分，会导致不完全固定，则DNA片段的平均长度会小于500bp。交联过度时细胞染色质难以用超声波破碎，就算延长超声波作用时间也会导致重要原料的丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。 ;3. 用500μl预热至室温带有蛋白酶抑制剂的SDS裂解液重悬并裂解细胞，冰浴10分钟； 超声波处理剪切染色质DNA，使其形成300-1000 bp即大约相当于2-5个核小体长度的片段； ① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 ② 设置超声破碎的条件 ③ 酶消化与超声消化相比较的区别 ; ① 超声条件对实验的影响及超声注意事项 超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生泡沫。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。 ; ② 设置超声破碎的条件 超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。 ;③ 酶消化与超声消化相比较的区别 Micrococcal Nuclease可以将染色质切成一到几个核小体，比超声波处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对DNA和DNA-蛋白复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。酶处理染色质适用于新鲜的细胞或组织样品和冰冻样品。在研究组蛋白时，经常采用没经过甲醛固定的Native ChIP（N-ChIP）的研究方法。因为N-ChIP没经过甲醛固定，超声波处理会打断组蛋白和DNA的结合，所以只能选择酶处理染色质的方法。对于甲醛固定的样品，一般选择超声波处理方法。也有研究人员使用酶处理的方法研究甲醛固定较温和的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme）提供。 ;Enzyme和sonication处理结果比较; 超声处理的条件需要优化，各实验组可采用不同的超声波处理条件，比较剪切效果。按以下步骤操作比较各种条件下的剪切效果： a. 将超声处理过的样品离心收集上清（ 4℃ 13000rpm离心10分钟），加入10μl 0.5 M EDTA、20μl 1M Tris-HCl、2μl 20mg/ml蛋白酶K，45℃ 孵育0.5-1 小时； b. 酚/氯仿抽提一次，乙醇沉淀并重溶于20μl的ddH2O中，1.2% 琼脂糖凝胶电泳检查。;酚/氯仿抽提步骤;5. 将超声处理过的样品在4℃ 13000rpm离心10分钟收集上清，10倍稀释，将其