_水中总大肠菌群的测定―多管发酵法(.).pdfVIP

水中总大肠菌群的测定 —多管发酵法 一．原理 总大肠菌群可用多管发酵法或滤膜法检验。多管发酵法的原理是 根据大肠菌群能发酵乳糖、产酸、产气，以及具备革兰氏染色阴性， 无芽孢，呈杆状等有关特性， 通过三个步骤进行检验求得水样中的总 大肠菌群数。试验结果以最可能数 （most probable number），简称 MPN 表示。 三．仪器 (1)高压蒸气灭菌器。 (2)恒温培养箱、冰箱。 (3)生物显微镜、载玻片。 (4)酒精灯、 3mm 接种环。 (5)培养皿 （直径100mm）、试管 （5 ×150mm），吸管 （1、5、10mL）、 烧杯（ 200、500、2000mL ）、锥形瓶（ 500、1000mL ）、采样瓶、移 液枪。 四．培养基及染色剂的制备 1．乳糖蛋白胨培养液：将 10g 蛋白胨、 3g 牛肉膏、 5g 乳糖和 5g 氯化钠加热溶解于 1000mL 蒸馏水中，调节溶液 pH 为 7.2～7.4，再 加入 1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1mL ，充分混匀，分装于试管中，于 121℃ 高压灭菌器中灭菌 15min，贮存于冷暗处备用。 2 ．三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液：按上述乳糖蛋白胨培养液的制 备方法配制。除蒸馏水外，各组份用量增加至三倍。 word. 3．伊红美蓝培养基： ①贮备培养基的制备：于 2000mL 烧杯中，先将 20g 琼脂加到 900mL 蒸馏水中，加热溶解。再加 2.0g 邻酸二氢钾及 10g 蛋白胨， 混合使之溶解，用蒸馏水补充至 1000mL，调节溶液 pH 值为 7.2～7.4。 趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入 10g 乳糖，混匀后定量分装于 250mL 或 500mL 锥形瓶内， 于 121℃高压灭菌 15min，贮于冷暗处备 用。 ②平皿培养基的制备：将上述制备的贮备培养基融化。根据锥形 瓶内培养基的容量，用灭菌吸管按比例分别吸取一定量已灭菌的 2% 伊红水溶液（ 0.4g 伊红溶于 20mL 水中）和一定量已灭菌的 0.5%美 蓝水溶液（ 0.065g 美蓝溶于 13mL 水中），加入已融化的贮备培养基 内，并充分混匀（防止产生气泡） ，立即将此培养基适量倾入已灭菌 的空平皿内，待冷却凝固后，置于冰箱内备用。 4．革兰氏染色剂： ①结晶紫染色液：将 20mL 结晶紫乙醇饱和溶液（称取 4～8g 结 晶紫溶于 100mL95%乙醇中）和 80mL 1%草酸铵溶液混合、 过滤。该 溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。 ②助染剂：将 1g 碘与 2g 碘化钾混合后，加入少许蒸馏水，充分 振荡，待完全溶解后，用蒸馏水补充至 300mL。此溶液两周内有效。 当溶液由棕黄色变为淡黄色时应弃去。 为易于贮备， 可将上述碘与碘 化钾溶于 30mL 蒸馏水中，临用前再加水稀释。 ③脱色剂： 95%乙醇。 word. ④复染剂：将 0.25g 沙黄加到 10mL95%乙醇中，待完全溶解后， 加 90mL 蒸馏水。 五．测定步骤 水源水 ①于各装有 5mL 三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液的 5 个试管中 （内有 倒管），分别加入 10mL 水样；于各装