生物工艺学第2章--基因工程工具酶1PPT课件.ppt

（3）识别位点及邻近位点特异性序列 如：pBR322 DNA 有 4个 NarⅠ切点 (GGCGCC)其中 2 个切点用1U 酶水解 1h 完全切开, 2 个切点用50U 酶水解 16h 水解不完全。 XmaⅢ 切点（CGGCCG）在GGCGGCCGCC时不切割。 （4）DNA 二级/三级结构 如：超螺旋 DNA (病毒或质粒) 比线状 DNA 需酶多 （5）提取时混入杂质可改变识别特异性 如： 高浓度 Hg2+、酚、 氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、NaCl 等。 2.反应系统因素 （1）缓冲液（无菌、无污染） （2）金属离子 如：Ⅱ型酶需 Mg2+，若以 Mn2+ 代替Mg2+（如HindⅢ，EcoRI）则特异性改变。 离子浓度不合适会抑制酶活。 （3）牛血清蛋白 (BSA) BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 限制性核酸内切酶的反应条件 3. 星活性 限制性内切酶识别特异性放宽。 EcoRⅠ在正常情况下识别 GAATTC 序列发生切割，但如果缓冲液中甘油浓度超过 5%，其识别位点发生松动，可在 AATT 处发生切割，EcoRⅠ这种特殊的识别能力叫做星活性，用 EcoRⅠ*表示。星活性可造成位点切割机率不等，降解不完全。 影响因素：甘油浓度 12-20%，酶与 DNA 比例，离子强度，45% 聚乙二醇 (PEG)，有机溶剂，8% 二甲基亚枫，二价阳离子，12% 乙醇。 限制性核酸内切酶的反应条件 重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸内切酶的应用 重组DNA前的切割 构建新质粒 构建物理图谱 DNA分子杂交 用限制性内切酶消化受体DNA 制备DNA探针 亚克隆以用作序列分析 基因定位，DNA同源性研究 限制性核酸内切酶的应用 ?甲基化酶分两类： 维持性甲基化酶：用于在新合成的 DNA 链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。 构建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA 链上进行甲基化的酶。 ??用甲基化酶进行甲基化的作用 封闭 DNA 链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。 构建新的酶切位点 DNA连接酶（ligase） 能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子. ds-DNA结构: 切口, 缺口, 断口 缺口(gap) 切口(nick) 断口(cut) 3HO P5 3HO P5 AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ 5′ 5′ (1) (2) AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ AATTC· · · · · · G G· · · · · · CTTAA 5′ 5′ (a)分子间连接 (b)分子内连接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4连接酶 T4连接酶 一. DNA的连接方法 两种不同的DNA分子可以经过下述的方法之一进行连接,而方法的选用则是根据其两者末端的DNA结构. 1. 直接连结法---该法适用于: 1)??同种限制酶作用不同DNA片段产生的相同粘性末端 重组DNA可用同种酶再切开 2) 不同种限制酶作用不同DNA片段产生的相容性末端 i.重组DNA分子不能再为这两种酶所作用,如:BamHI/BglII ii.重组DNA分子可为其中一种酶所作用,但