神经元原代培养.docVIP

神经元原代培养 一、准备 1•试剂 1） 胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个，并 加入与血清等体积的水。对照瓶内插入 1〜2支温度计（保证测试温度的准确性）。将血 清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至 56C时，定时30分钟。 灭活后分装，10ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20〜-70 C保存。 2） D-Hanks 液（g/L） : NaCI: 8, KCl: , KHPO4: , NaHP（42HO: , NaHCOa：;酚红：， 超纯水溶解，调节PH至，高压灭菌（购自南方医院临床试验中心）。 3） 多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤,200 ^1或400卩l/tube分装，-20度 储存。 母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为ml （购自Sigma, P2636, 100mg。配置方 法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超纯水稀释为 ml的工作液。 4） 50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装 50卩l/tube，-20 C保存。使用时需将 终浓度调整为25卩M （购自Sigma, G8415 100g，分子量：）。配制方法：电子天平称 量谷氨酸，即=10mmol溶于200ml超纯水中，配制为 50mM勺谷氨酸母液。 例：500ml 的 Neurobasal Medium中加入 Glutamate 母液（50mM 250 卩 l，此时终 浓度约为25卩M 5） 胰蛋白酶：％ （购自 Hyclo ne,，100ml）。 6） 阿糖胞苷（AraC）母液：10mM （阿糖胞苷，1： 1000稀释用）（购自Sigma, C1768, 100mg 分子量：）； 配制方法：100mg/~，加入 41ml超纯水溶解，配制成 10mM的 AraC 母液。 AraC工作液：10卩M （半量换液，终浓度 5卩M ； 7) DNAse I ()(购自 ROCH, 100mg 1mg=2000U 用 dHO配成 10mg/ml母液，过滤 分装100卩l/tube，每次使用50-100卩l ） Q\ 拉餐甘 8) 培养基 FBS DMEM/F12 购自 Hyclone ,, 500ml 双抗：购自GIBCO, 100ml Neurobasal Medium-A :购自 GIBCO （新生鼠）或（孕鼠），500ml B27:购自 GIBCO 17504-044, 10ml Glutamax-100X:购自 GIBCO 3505061, 100ml ① 分离培 养基: 10%FBS+DMEM/F1 双抗 ② 培养用 Start Medium: Neurobasal Medium-A500ml+B2710ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25 ③ 换液用 Culture Medium: Neurobasal Medium-A500ml+B271 0ml+Glutamax 100X 5ml 2. 耗材 1） EMS盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。 2） 各型枪头：10卩l、100卩l、1000卩l、5ml 3） 细胞培养皿: 4） 细胞培养瓶： 5） 离心管： 二、步骤 1. 手术器械消毒：直头眼科剪、直头、弯头显微镊各 1 把为一套器械，准备两套并分 别置于 50ml 烧瓶中， 70%酒精浸泡 30min。 2. 动物：出生24小时内的SD大鼠（下称乳鼠）约10只； 3. 海马组织分离： ① 培养皿2个，分别加入冰冻D-Hank s液约5ml，至于冰盘上； ② 取乳鼠，用左手拇指和食指固定乳鼠头部，酒精棉球皮肤消毒 3遍，直头眼科剪酒 精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤，换第二把直头眼科剪剪开颅骨，弯头显微镊向两 侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑，换第二把弯头显微镊由颅底部分离乳鼠大脑，然后置入 冰冻的D-Hanks液中。 ③ 用直头显微镊固定乳鼠大脑，将两大脑半球分离后，用弯头显微镊分离脑干后，以 直头显微镊固定并敞开皮质，最后用弯头显微镊由海马游离端仔细分离海马组织，并 剔除血管及脑膜。 ④ 将分离好的海马组织至于加有冰冻 D-Hank s液的青霉素瓶中，用直头眼科剪剪碎 组织至约1mm勺小块，加入约5倍组织体积的％夷蛋白酶37C消化10min,加入分离培 养基终止消化。 ⑤ 机械吹打分散细胞，40叩 筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心6min,弃 去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成 4X 105个/ml的单细 胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内。 ⑥ 在通以95烷气、5%CQ 37C细胞培养箱中培养。接种72h后，加入含10卩M阿糖胞 苷的Cultu