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2016-11-16 Western Blot实验技术及常见问题分析 Western blot 定义 Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上 分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 是蛋白质分析的最流行的技术之一 Western blot 原理 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western blot 原理 Western Blot操作流程 蛋白样品的制备 （蛋白抽提、定量） SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 （SDS凝胶制备、上样） 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液： 50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 ， 0.05% PMSF ， 2μg/mL Aprotinin, 0.5μg/mL Leupeptin ， pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括乙醇、丙酮和丁醇等。 一、蛋白样品的制备 蛋白样品的定量(Bradford法 ) 原理—考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 制作标准曲线 （插入表格） 检测样品蛋白含量：取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品，混匀后静置2min，倒入比色杯中测试。 目前世界上最常用的蛋白浓度检测方法是： BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit) Bradford法蛋白定量试剂盒（Bradford Protein Assay Kit) 。 二、蛋白定量 BCA蛋白浓度测定试剂盒 BCA 法与传统方法相比，更简单、更稳定、更灵敏度。 BCA法测定蛋白浓度兼容性亦很好，其不受大部分样本中其他成分的影响，对于5%以内的SDS、Triton X-100、Tween 20、 Tween 80具有很好的兼容性。 BCA法测定蛋白浓度易受螯合剂、高浓度的还原剂影响。在BCA法测定蛋白浓度前，应尽量使EDTA浓度≤m10M; DTT浓度≤1mM，2-ME≤0.01%。 BCA法在50～1000μg/ml浓度范围内有较好的线性关系， 其最小检出量为25μg/ml。 20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致：每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本 三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 蛋白质带有负电荷，因此电泳时可以从负极向正极移动 Anode - 内槽缓冲液带有负电荷，与凝胶顶部接触 外槽中缓冲液带有正电荷，与凝胶底部接触 Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动（负极到正极），分开 电泳进程可以根据前沿指示剂来确定，等其跑到底部上面1cm左右即可停止电泳 小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开 标本加入到上样孔中 膜 四、Western Blot 转膜 分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上（PVDF或NC膜） PVDF膜：价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜（硝酸纤维素膜）：价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。 Western Blot 的具体步骤 转膜 转膜准备 制作“三明治” “黑胶白膜” Western Blot 的具体步骤 转膜 Western Blot 的具体步骤 转膜 转膜条件： 推荐：100V ，1——2小时；根据蛋白大小以及胶厚度的不同而不同。 Western Blot 的具体步骤 转膜后检测：