引物设计流程之基因编码区(CDS)扩增引物设计.pdfVIP

PCR引物设计流程 （以扩增鹅 PHIP基因编码区序列为例） 一． 流程图 二． 确定模板 1. 确定模板来源物种 近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等 常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴） ，哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗） ，爬行类（鳄，龟）， 两栖类（蛙，蟾蜍） ，鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼） 一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择 2 种以上作为模板。如，扩增鹅 PHIP基因选择以 下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2. 利用 NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列 A. 进入 NCBI主页 / ，选定搜索范围为“ Gene”，关键词为“ PHIP”，得到如 下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“ PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都 可使用 ）。 B. 点击所需物种的 PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人 PHIP基因为例）。基因报告 页面中部 Refseq 条目 中显示该基因在 NCBI中的参考序列，该条目下可得到 mRNA序列。如下图。另，关于 RefSeq条目 的相关名词解释参考 /refseq/about/ 。 C. 需注意：对于同一基因的 mRNA可能具有不同长度的剪切异构体，选择模板时不同物种应尽量 选择同 一异构体 （一般选择最长的异构体 ）。 D. 如需得到该基因所在基因组的序列信息 （如扩增启动子区域时），在基因报告 页面上部 Genomic regions， transcripts ，and products 条目下 ，点击 Go to nucleotide 选项下 FASTA按钮可进入 基因组（组装）序列 页面。 E. 在基因组（组装）序列页面中， 默认仅显示跳转前基因的序列 ，在 Change region show 条目 中修改设 置为 Whole sequence 得到基因组序列，在 Send选项下保存即可。 3. 整理下载的模板序列 三． 寻找保守区域 保守区域的意义：基因的保守区域是指 不同来源的同一个基因在某些区域没有差别或者差别很小 。在扩增基 因序列时，选择 在保守区域设计引物能够更有效的扩增未知的基因 。因此，在引物设计前需先找出目的序列 中的保守区域。在引物设计时，则首先应在保守区域内设计引物。 1. 制作 mega 标准序列 A. 用 ClustalX软件打开整理好的 TXT文件（菜单 File →Load Sequences），然后在菜单 Alignment 选项下选 择 Do Complement Alignment ，此时将保存两种格式文件： .dnd 和.aln（序列较长时耗时较长， 需数分钟）。 B. 将以上 .aln 文件 用 DAMBE软件打开 （File→Open standard sequence file），注意选择恰当的序列类型。 打 开后的文件可直接转存为 .meg 或 .fas 格式文件（ File→Save or Convert Sequence Format）。 注 1：此时在 Sequence Info 对话框应选择 Binary 选项，否则在转换格式时 T 碱基会被替换为 U。 2. Mega 分析同源性 A. 用 Mega 软件打开以上保存的 .meg 或 .fas格式文件，新建一个序列对齐分析窗口（ Align → Edit/Build Alignment →Retrieve sequences from a file）。 B. 在新窗口中以默认设置将序列集进行序列对齐分析（ Alignment →Align by muscle （Codons）），结果保存 为