双向电泳常见问题解答——水平条纹心得点评.pdfVIP

双向电泳常见问题解答（一）——水平条纹 [心得点评 ] 作为经典蛋白质组学分离技术， 双向电泳越来越被科研人员所熟知。 但要想得到漂亮的 双向电泳谱图， 却并不那么容易。 我们将针对双向电泳过程中常出现的问题进行总结， 希望 能给您的实验带来帮助。 本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。 双向电泳水 平条纹的产生主要来自于样品本身和一向等电聚焦电泳， 下面就从这两方面的原因及其解决 办法进行详述。 随着人类基因组草图完成， 蛋白质组研究全面展开。 作为经典蛋白质组学分离技术， 双向电 泳越来越被科研人员所熟知。 但要想得到漂亮的双向电泳谱图， 却并不那么容易。 我们将针 对双向电泳过程中常出现的问题进行总结，希望能给您的实验带来帮助。 本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。 双向电泳水平条纹的产生主要来自于 样品本身和一向等电聚焦电泳，下面就从这两方面的原因及其解决办法进行详述。 一、样品制备问题 1．样品中存在影响等电聚焦的杂质 蛋白样品中任何离子净电荷的污染都将影响等电聚焦， 并引起水平条纹。 严重的污染物干扰， 我们在等电聚焦过程中可以观察到：低电压运行时，软件和仪器监测到的电流很快就达到 50 Aμ 的限定，预设的高电压不能达到； 严重时可能导致电弧产生或 IPG 胶条燃烧。常见的 污染包括样品制备过程中引入的盐和其他带电小分子、 去污剂；以及样品本身内源性的杂质， 包括各种内源性的带电小分子，核酸、多糖、脂类、酚类等非蛋白杂质。了解样品中主要污 染物的组成，并且在样品制备过程中采取有针对性的办法去除污染物即可改善水平条纹。 盐和带电小分子：水化上样将盐离子浓度降低到 10 mM 以下，而杯上样则限制样品盐浓度 不超过 50 mM 。脱盐常用脱盐柱、旋转透析或透析袋；而用 TCA 和丙酮沉淀再重悬，是一 个更有效的脱盐方法，但往往 TCA 清除不尽，蛋白复溶效率不高。 2-D Clean-Up Kit （货 号 80-6484-51 ）则采用专利的共沉淀剂和洗涤附加物， 可以定量沉淀各种来源的蛋白质， 蛋 白复溶率通常大于 90% 。使用 2-D Clean-Up Kit 不会造成斑点增加或减少， 或斑点位置的变 化，操作简单，整个过程可以在一个小时内完成。另外，使用劣质水、尿素或其他试剂也会 造成导电性升高； 尿素还易分解为带电的产物。 选用优质试剂， 重要的试剂包括尿素、 硫脲、 DTT 、去污剂、 载体两性电解质、 水等， 防止一向等电聚焦所需的这些试剂因本身纯度不够， 而引入带电杂质。即使选择了优质尿素、硫脲，保存得当也非常关键。尿素、硫脲吸水后会 发生离子化， 影响等电聚焦。 样品中盐离子浓度还可以通过改变 IEF 的程序来降低。 先设一 步或几步低压程序，如 100V 3h ， 100v1000v gradient 3h ，然后再升高电压完成 IEF，这 个低压程序可以使样品中的离子首先迁移到 IPG 胶条的末端，降低电内渗，减少水平条纹 的形成。 带电荷的去污剂：最常用的离子型去污剂如 SDS，能够包被蛋白，并彻底改变它们的净电 荷，最终影响它们的等电点，导致条纹出现以及 IPG 胶条中样品的损失。如果在样品中存 在 SDS，那么其用溶胀液稀释后的最终浓度不能超过 0.25% 。或者， 添加其他非离子型去污 剂或兼性离子