讲义教案生化下核酸.pptx

核酸分类和分布;RNA的一级结构 ;转运RNA（Transfer RNA，tRNA）; tRNA的分子量一般在25-30KD范围，沉降常数约4S，由73-93个核苷酸组成，其中含大量稀有碱基，如假尿嘧啶核苷(ψ)，各种甲基化的嘌呤和嘧啶核苷，二氢尿嘧啶(hU或D)和胸腺嘧啶(T)核苷等。对绝大多数原核细胞和真核细胞一个tRNA分子来说，一般有 10-15个稀有碱基。这些稀有碱基的功能不十分清楚。;三叶草型的tRNA的二维结构 (1) 5’端和3’端配对（常为7bp）形成茎区，称为受体臂（acceptor arm）或称氨基酸臂 。在3’端永远是4个碱基（XCCA）的??链区，在其末端有2’-OH或3’-OH，是被氨基酰化位点。此臂负责携带特异的氨基酸。 (2) TψC常由5bp的茎和7Nt的环组成。此臂负责和核糖体上的rRNA 识别结合；;（3) 反密码子臂 (anticodon arm)常由5bp的茎区和7Nt的环区组成，它负责对密码子的识别与配对。 (4) D环 (D arm)的茎区长度常为4bp，环区为8-12个核苷酸，有两个二氢尿嘧啶,也称双氢尿嘧啶环。负责和氨基酰tRNA聚合酶结合; (5)额外环(extra arm)可变性大，从4 Nt到21 Nt不等，其功能是在tRNA的L型三维结构中负责连接两个区域（D环－反密码子环和TψC-受体臂）。;tRNA的三维结构 ; (5)几乎所有的碱基其轴向使得碱基平面之间产生堆积的作用。这种作用也是tRNA构象稳定的主要因之一。?????? (6)在反密码子茎中仅有很少的三级氢键，这可能由于在蛋白质合成时，反密码子区的相对方向会发生改变之故。 ;Nucleic Acid Properties;(一)核酸物理性质;DNA的一级结构:（磷酸二酯键） 构成DNA的脱氧核苷酸按照一定的排列顺序，通过3’,5’-磷酸二酯键相连形成的线形结构。 ;糖苷键: 由戊糖和碱基缩合而成。糖和碱基之间以糖苷相连接。糖的第一位碳原子(C1)与嘧啶碱的第一位氮原子(N1)或与嘌呤碱的第九位氮原子(N9)相连接。所以，糖与碱基间的连键是N-C键，一般称之为N-糖苷键。 ;核酸的水解;（一）酸或碱水解; In contrast to DNA, RNA is very unstable in alkali solutions due to hydrolysis of the phophodiester backbone. The 2OH group in ribonucleotides renders RNA molecules susceptible to strand cleavage in alkali solutions. ; (二）酶水解;RNase：RNA水解酶;DNase 即Deoxyribonuclease ，称为脱氧核糖核酸酶，是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶。;核酸内切酶 endonuclease ： 是在核酸水解酶中，水解DNA分子链内部磷酸二酯键生成寡/寡聚核苷酸的酶。从对底物的特异性来看，可分为DNaseⅠ等仅分解DNA的酶；脾脏RNase等仅分解RNA的酶；还有就是如链孢霉核酸酶这类既分解DNA又分解RNA的酶。一般来说，大都不具碱基特异性，但也有诸如HindⅢ、EcoRⅠ等具有限制性的，能够识别并切断特定的碱基或碱基序列的酶。 ; 限制性内切酶; 某些细菌可以通过可以合成核酸酶特异地破坏侵入的病毒DNA来阻止嗜菌体的感染。 该酶可在特殊的序列区降解外源DNA，但宿主细胞本身的DNA并不受该核酸酶的作用。这是因为宿主DNA可被内切酶识别的特殊部位的某些碱基已经被甲基化了，内切酶不能催化已修饰底物的水解。所以任何进入宿主细胞的，在酶识别的特殊部位没有甲基化的DNA都会受到限制性内切酶的切割。;限制性内切酶;Ⅱ类限制性内切酶;酶的定义: 在标准条件下,1小时完全消化1μg线型DNA分子所需的酶量定义为1U； 影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性质； 识别序列在DNA中的分布频率； 与DNA的构象有关（SC,L,OC）； DNA的纯度（蛋白、氯仿、SDS、EDTA等）； ;酶切反应的操作步骤;充分混匀后，用离心机短时（10秒）离心，置所用限制性内切酶最适温度水浴中，酶切1－3小时，酶切过夜则建议改用稍大的酶切体积，以避免水分蒸发过多影响的酶切体系各组分浓度改变过大; 置65℃水浴中10分钟，对限制性内切酶进行灭活，不同的酶灭活条件可能不同，请参照说明书进行; 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切反应的结果;;酶切反