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microRNA （miRNA ）引物设计及过程原理说明 microRNAs 的平均长度 23nt 左右，所以 miRNA 引物设计与常 规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个 miRNA 引物设计 的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。 首先，引物设计之前先介绍 miRNA 反转录合成 cDNA 的过程。 我们拿经典颈环序列 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGAC 作介绍。打开 DNAstar 软件的 PrimerSelect ；file 打开 下拉菜单； 打开 Enter New Primer …；粘贴颈环序列； 点击 OK 。 颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。 选择颈环结构 （鼠标点一下）；点击 Report 下拉菜单；选择 Primer Hairpins 。 第一个发夹结构是实验所需的结构 (dG=-20.4kc/m) 。 下面结合 has-miR-122-5P 合成 cDNA 的具体过程讲解 has-miR-122-5P ：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将 U 转 T ，方便后面使用： TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT miRNAs 的颈环结构引物： 是将 miRNAs 的 3 ’端后6 位碱基反向 互补添加到经典颈环结构的 3 ’端形成的结构。( 自己根据后面图 片想一下原因，加 6 个碱基为经验所授 ) has-miR-122-5P 的后 6 位： GTTTGT has-miR-122-5P 的后 6 位的 反向互补 序列： ACAAAC 颈环引物序列： 5 ’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGG ATACGACACAAAC -3 ’ 查看形成的发夹结构（方法前面有讲） 看一下 miRNA 和颈环引物在一起会是怎么样子： 在含反转录酶及适当的条件下， miRNA 和其颈环引物将会合成 cDNA 链： GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT ACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA 查看 cDNA 结构： 我们知道了 cDNA 的合成过程和序列，同时学习了 miRNA 的反 转录过程。 下面进入重头戏，教大家如何进行 miRNA 引物设计。首先如果 你的前面实验是芯片的就在 miRbase 上再查看核对一遍，如果 是测序实验的需要将 miRNA 的名字 3p 或 5p 及之前的部分复制 到 miRAN 上查找完整序列。将得到的 miRNA 完整序列复制到 一个 excel 表中， 然后使用查找替换将 U 改为 T （一定要记住改 换，要不然 primer5.0 是不认 U 的）。 为了后面引物设计方便，需要以 miRNA 序列构建引物，所以需 要将 miRNA 的 cDNA 的反向互补序列找出。使用 primer5.0 。 打开 File 下拉菜单； New ；DNA Sequence 。 由于正规设计过程中不会先把