基因工程第6章 DNA重组的操作1.pptx

Review;第三部分 目的基因的分离;一、目的基因的功能克隆;二、 序列克隆法;三、差别杂交法;;;四、减法杂交技术;mRNA减法杂交;减数杂交技术分离 差异表达基因;五、mRNA差别显示技术;3 ’端锚定引物;5’端随机引物;;差别显示分析基本流程;基本程序;优点：;缺点：;;第一节 受体细胞;1、原核生物细胞;;常用受体菌：;2、真菌细胞;3、植物细胞;4、动物细胞;第二节 重组体导入受体细胞;2.1 重组质粒DNA转化大肠杆菌;1.定义 转化：受体菌直接吸收供体菌的DNA片断而获得后者部分遗传性状的现象。 转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。 2.转化微生物的种类 首次发现转化现象 肺炎链球菌（Griffith,1928） 嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、奈瑟氏球菌属、根瘤菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、黄单胞菌属等。;3. 感受态（competence） 感受态：指受体细胞最易接受外源DNA片断并能实现转化的一种生理状态。 感受态是细菌的一种遗传特性，而且也受生长阶段、培养条件的影响。 肺炎链球菌 对数生长后期 芽孢杆菌属 指数期末和稳定期 大肠杆菌 刚进入对数期; 大肠杆菌 革兰氏阴性菌 细胞表面的结构和组成与革兰氏阳性菌不同 转化因子的吸收较为困难 人工制备感受态细胞;大肠杆菌的转化方法： Ca 2＋诱导大肠杆菌转化法 电穿孔转化法 三亲本杂交接合转化大肠杆菌;;制备感受态细胞的注意事项;;;;感受态细胞的制备;细胞的转化;; 提高转化效率的因素： Mg Cl 2与CaCl2 共同处理 二甲基亚枫（DMSO ）、二硫苏糖醇 （DTT） 提高100～1000倍，易污染 RbCl、MnCl 2、LiCl和KCl等与CaCl2多盐处理; 对照处理： DNA对照处理： 无菌水代替感受态细胞，检验DNA溶液 感受态细胞对照处理： NTE缓冲液代替DNA溶液，检验感受态细胞 感受态细胞有效性对照处理： 加入已知的容易转化的质粒DNA;2、电穿孔转化法（P140）;3、三亲本杂交接合转化大肠杆菌;4、转化率： DNA分子转化受体菌获得转化子的效率;影响转化率的因素：;;2.3 重组DNA分子导入植物细胞 (P144); 选择合适的外植体 根据受体细胞的转化能力来决定 农杆菌的接种操作（接种到损伤切面，使农杆菌与外植体共培养） 洗菌并筛选培养（无菌水清洗共培养后的外植体，无菌滤纸吸干后转移到筛选培养基上，杀死或抑制附着于表面的农杆菌）;创伤植株感染法（植株接种共转化法） 共培养感染法 叶盘转化法 植???愈伤组织共培养转化法 植物悬浮细胞共培养转化法 原生质体共培养转化法;创伤植株感染法（植株接种共转化法）;2021/7/4;共培养感染法; 叶盘转化法;2021/7/4;植物愈伤组织共培养转化法;（2）DNA的直接转移法; 基因枪法 P146;;;2.4 重组DNA分子导入哺乳动物细胞 P148;要点;9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。七月-21七月-21Tuesday, July 06, 2021 10、低头要有勇气，抬头要有低气。22:41:3022:41:3022:417/6/2021 10:41:30 PM 11、人总是珍惜为得到。七月-2122:41:3022:41Jul-2106-Jul-21 12、人乱于心，不宽余请。22:41:3022:41:3022:41Tuesday, July 06, 2021 13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。七月-21七月-2122:41:3022:41:30July 06, 2021 14、抱最大的希望，作最大的努力。06 七月 202110:41:30 下午22:41:30七月-21 15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。。七月 2110:41 下午七月-2122:41July 06, 2021 16、业余生活要有意义，不要越轨。2021/7/6 22:41:3022:41:3006 July 2021 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。10:41:30 下午10:41 下午22:41:30七月-21