RT-PCR引物设计原则和方法-dy.pdf

RT-PCR 引物设计原则和方法 近刚开始做 PCR，参考了很多与引物设计相关的帖子，结合自己使用 primer5 和 oligo 的体会，想 谈谈自己设计引物的方法和步骤，恳请各位前辈指正。 RT-PCR 引物设计原则和方法 在 NCBI 上搜索到该基因，找到该基因的 mRNA ，在 CDS 选项中，找到编码区所在位置，在下面的 origin 中， Copy 该编码序列作为软件查询序列的候选对象。 打开 Primer Premier5 ，点击 File-New-DNA sequence, 出现输入序列窗口， Copy 目的序列在输入 框内（选择 As ），此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白。点击 Primer ，进入引物窗口。 此窗口可以链接到 “引物搜索 ”、 “引物编辑 ”以及 搜索结果“ ”选项，点击 Search 按钮，进入引物搜索 框，选择 “PCR primers ”， “Pairs，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在” Search Parameters 里 面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为 100 ～200bp 的产物电泳跑得较散，所以可以选择 300 ～ 500bp 。 点击 OK ，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分 （Rating ）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在 “引物窗口 ”中，显示出该引物的综合情况，包 括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。 对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’端不要以 A 结尾，最好是 G 或者 C， T 也可以； 3 ’不要出现连续的 3 个碱基相连的情况，比如 GGG 或 CCC ，否则容易引起错配。此窗口 中需要着重查看的包括： Tm 应该在 55 ～ 70 度之间， GC％应该在 45 ％～ 55 ％间，上游引物和下游 引物的 Tm 值最好不要相差太多，大概在 2 度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结 构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在 该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这 些二级结构，即这几个按钮都显示为 “None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要 求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影 响产物。对于引物具体详细的评价需要借助于 Oligo 来完成， Oligo 自身虽然带有引物搜索功能， 但其搜索出的引物质量感觉不如 Primer5 。 在 Primer5 窗口中，若觉得某一对引物合适，可以在搜索结果窗口中，点击该引物，然后在菜单 栏，选择 File-Print-Current pair ，使用 PDF 虚拟打印机，即可转换为 Pdf 文档，里面有该引物的详 细信息。 在 Oligo 软件界面， File 菜单下，选择 Open ，定位到目的 cDNA 序列（在 primer 中，该序列已经 被保存为 Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为 Internal Stability （Delta G ）窗口和 Tm 窗口。 在 Tm 窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置 （Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击 Change －Current oligo length 来改变。定 位后，点击 Tm 窗口的 Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击 Lower 按 钮，确定下游引物。引物确定后，即可以充分利用 Analyze 菜单中各种强大的引物分析功能了。 Analyze 中，第一项为 Key info ，点击 Selected primers ，会给出两条引物的概括性信息，