Westernblot原理和技术上课.pptVIP

不可不加--内参的选择 原因：校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差 种类：GAPDH、beta-actin、beta-tubulin 用法： 二抗孵育时加入HRP标记内参抗体 分子量相差不大 分子量大小相差比较明显 第二十八页，编辑于星期二：十九点 十分。 Western Blot注意事项及常见问题 第二十九页，编辑于星期二：十九点 十分。 SDS）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。 2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2 (载荷面即：如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：1mm×5mm=5mm2) 。 3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。 4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。太慢不均匀，特别是甘油。 第三十页，编辑于星期二：十九点 十分。 SDS）电泳中常出现的一些现象： ︶ 条带呈笑脸状，原因：凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。 ︵ 条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。 拖尾：样品溶解不好。 纹理（纵向条纹）：样品中含有不溶性颗粒。 条带偏斜：电极不平衡或者加样位置偏斜。 条带两边扩散：加样量过多。 第三十一页，编辑于星期二：十九点 十分。 TRANSFER 1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸=膜=胶。 2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。 3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。 第三十二页，编辑于星期二：十九点 十分。 TRANSFER 4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。 5）转移时间一般为1.5 小时，( 1mA-2mA/cm2，10% gel)，可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。 第三十三页，编辑于星期二：十九点 十分。 转膜及抗体检测 凝胶肿胀或卷曲？ 单个或多个白点？ 转膜缓冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min 电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治”结构不紧凑导致。可在两块海绵之间垫上滤纸 确保膜和胶块之间没有气泡 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降温 第三十四页，编辑于星期二：十九点 十分。 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉反应 抗体浓度过高 原因 对 策 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 背景太高 第三十五页，编辑于星期二：十九点 十分。 为什么要作蛋白质印迹实验？ 研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，如疾病和正常的样品之间的表达差异性。 第一页，编辑于星期二：十九点 十分。 定义： 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern印迹法。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法 Towbin, H., et al. (1979). Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354. 第二页，编辑于星期二：十九点 十分。 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 第三页，编辑于星期二：十九点 十分。 基本流程 提取细胞或组织蛋白、测定大致含量 ↓ 制备SDS胶 ↓ 蛋白样品变性、电泳 ↓ 电泳转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤 ↓ HRP标记的二抗