外泌体提取方法比较.pdfVIP

外泌体（ Exosome）发现于 1986 年，是一种直径约 30~100nm的双层膜囊泡状结构 小体，可由机体多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、 神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹 水、羊水等体液中。 外泌体携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以与功能性的 mRNAs、 miRNAs等生物活性物质，在体参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等 生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关 [1][2] 。由于外泌体的特殊结构和功能，使 得它具有潜在的应用价值，一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，另一方面也可 以作为治疗手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床治疗。 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，获得高纯度的外泌体对后续的研究 至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方 法实现外泌体的提取分离： 1、超速离心法（差速离心） 超 离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如下图）， 可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受 欢 迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑； 此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量 [3] 。 2、密度梯度离心 在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分 离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在 1.13-1.19g/ml 的密度围富集。此法 获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。 3、超滤离心 [4] 由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对 分子质量 (MWCO)的超滤膜对样品进行选择性分离，便可获得外泌体。超滤离心法简单 高效，且不影响外泌体的生物活性，是提取细胞外泌体的一种新方法。 4 、磁珠免疫法 1 / 3 外泌体表面有其特异性标记物（如 CD63、CD9蛋白） [5] ，用包被抗标记物抗体的磁珠与 外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。磁珠法具有特异性高、操作 简便、不影响外泌体形态完整等优点，但是效率低，外泌体生物活性易受 pH和盐浓度 影响，不利于下游实验，难以广泛普与。 5、PEG-base 沉淀法 聚乙二醇（ PEG）可与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，早先应用于从血清等样本中 收集病毒，现在也被用来沉淀外泌体，其原理可能与竞争性结合游离水分子有关。利 用 PEG沉淀外泌体存在不少问题：比如纯度和回收率低，杂蛋白较多（假阳性），颗 粒大小不均一，产生难以去除的聚合物，机械力或者吐温 -20 等化学添加物将会破坏外 泌体等，因此发表文章时易受质疑。 6 、试剂盒提取 近几年来，市场上已出现各种商业化的外泌体提取试剂盒，有的是通过特殊设计的过 滤器过滤掉杂质成分，有的则采用空间排阻色谱法 (SEC)进行分离纯化，也有的则利用 化合物沉淀将法外泌体沉淀出来。这些试剂盒不需要特殊设备，随着产品不断更新换 代，提取效率和纯化效果逐渐提高，因而逐渐取代超速离心法并推广开来。有些试剂 盒操作简便，不用超速离心，同时可获得高纯度和高回收率的外泌体——如 101bio 开 发的系列试剂盒 ，可分别针对尿液、血液、细胞上清液等多种样品进行提取 [6][7] ，并可 进一步从外泌体中获得想要的蛋白质或者 RNA分子，方便快速，因而受到大多数人的 欢迎，并发表了不少高质量的文章！ 然而，市场上各类产品纯化效果良莠不齐，目前仍没有绝对的方法或试剂盒能满足所 有要求，从各类样品中分离到理想的外泌体。 参考文献：