His标签蛋白纯化实验步骤.docVIP

Gad勺 kino His标签蛋白纯化实验 通过实验，学习和了解 His-Tag 融合蛋白的表达、纯化原理和方法，掌握相关仪器设备的 操作使用。 、实验原理 金属螯合离子亲和色谱 （IMA。是常见的亲和纯化方案之一，主要利用介质配体螯合的 金属离子吸附纯化表面带组氨酸、 色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。 His-tag 融合蛋白是目前 最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表达方便而且基本不影响蛋白的活性。 Ni IDA Beads可以用于各种表达来源（如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞） 的组氨酸标签（6xHis-tagged ）蛋白的纯化。它是以 4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法 偶联了三配位的亚氨基二乙酸（IDA），螯合镍离子（Ni）后，可以形成比较稳定的平面四 边形结构，从而有更多的位点与组氨酸标签上的咪唑环继续配位， 达到结合目的蛋白的效果 （产品化学结构见图1.1所示）。 、实验准备 试剂  实验仪器和设备移液器、恒温振荡箱、超声破碎仪、离心机、紫外检测仪、冰箱 三、实验步骤 第一步、菌体制备 1取2支4ml LB 培养基试管，超净台中操作。每管加入 4ul菌种，4ul氨卞青霉素。 放入37度恒温振荡箱180rpm，过夜培养，16小时。 2、将菌种加入800ml LB 培养基，800ul氨卞青霉素，放入 37度恒温振荡箱180rpm培 养 4 小时，OD600 约 0.6-0.8 。 3、加入IPTG 800ul，放入37度恒温振荡箱180rpm 培养4小时。 4、离心8000rpm 离心10min 收集菌体，-80度保存菌体。 第二步、菌体破碎 1、将菌体取出，加入 50ml Lysis Buffer 磁力搅拌悬浮，待无明显块状即可。 2、 超声4s停6s，36°保护温度，超声 30min。 3、将破碎好的裂解液离心取上清( 11000rpm ,20mi n ,4 C),准备上样。 第三步、蛋白纯化 1将HisPur Ni IDA Colu mn 固定在铁架台上，依次去掉下端塞和上端塞，流干预装柱的 保护液 2、 向柱管中加入 5mL Lysis Buffer ，平衡柱子，流干 Lysis Buffer 后，再重复2次, 共使用 15mL Lysis Buffer 平衡。 3、 将处理好的样品加入柱管，收集流出液。 4、向柱管加入5mL Lysis Buffer 冲洗柱管，进行洗杂，去除非特异性吸附的杂蛋白，收 集洗杂液。Lysis Buffer 流干后，再重复 5次，共使用30mL Lysis Buffer 洗杂。 5、使用15-30mL的Elution Buffer 进行洗脱目的蛋白，分段收集，每 5ml收集一管, 分别检测，这样，既可以保证所有结合的目的蛋白被洗脱， 又可以得到高纯度和高浓度的蛋 白。 6、依次使用5mL Lysis Buffer和5mL去离子水交替平衡填料，重复 2次，最后再用5mL 20%勺乙醇平衡填料，重复 1次，然后添加10mL 20%勺乙醇到柱管中，置于 4度保存，防 止填料被细菌污染。 第四步、样品检测 1、用紫外分光光度计中检测洗脱收集液蛋白浓度 OD280,计算回收的蛋白量。 2、用移液器各量取10ml的原样、流出液，洗杂液，洗脱液上 SDS— PAGE胶电泳，以检测 纯化出来的蛋白纯度。 G Ata 刁 Idnm