NK细胞的分离 模板.docxVIP

PAGE PAGE 1 NK细胞的分离 常用玻璃器皿吸附法（原理及办法同淋巴细胞的分别和纯化）：用含5％小牛血清的PRMI-1640培养基将单个核细胞配成细胞悬液，将细胞悬液置于玻璃平皿内，37℃静置30～60分钟。单核细胞即吸附于平皿表面，吸去非吸附细胞（淋巴细胞），用尖吸管反复吹打吸附于玻璃表面的单核巨噬细胞，或用橡皮刮轻轻刮离，使黏附的单核细胞脱落，并收集配成细胞悬液，经非特异醋酶染色（单核细胞为阳性）证实其纯度，锥虫蓝拒染法计算存活率，其存活率应大于95%,4℃保存备用。 NK细胞的分别【原理】NK细胞即自然杀伤细胞（natural killer cell,NK )，是一群具有自然杀伤能力的大颗粒淋巴细胞。它们不需要抗原激活，也没有MHC限制性，能挺直杀伤肿瘤细胞。成熟的NK细胞离开骨髓进入外周免疫器官，主要分布在脾脏和外周血中，约占外周血的3%,NK细胞没有黏附作用。在此介绍Percoll不延续密度梯度分别法分别NK细胞。【材料】1. pH 7.3缓冲液；327mg2.63g222mg2.55 mg蒸馏水加到 100m12．聚蔗糖-泛影葡胺分层液（D=1.077±0.001）；3. Percoll ( Pharmacia）产品；4. Hanks液（含5％）。【办法】1．外周血单个核细胞的分别将外周血与缓冲液按7:1比例混合后离心，1000r/min,10分钟，弃上清液，注重勿触及细胞沉淀，用吸管当心吸取细胞沉淀上面富含白细胞的部分，以3倍体积的Hanks液稀释细胞，置于聚蔗糖-泛影葡胺分层液上，离心，2000r/min,20分钟，当心吸取界面白细胞部分，用Hanks液洗2次，配成(0.5～1)x108/ml。2．非延续Percoll密度梯度离心（1）将Percoll渗透压调节到285mOsmol/kg H20;(2）制备7种不同的Percoll分层液，范围为40％～57.5%，每梯度相差2.5%，40%,42.5%,45%,47.5%,50%,52.5%,55%,57.5%；(3）将不同梯度的Percoll轻轻地一层层铺起，从高密度至低密度，最后加l ml细胞悬液于顶部离心，2000r/min离心30分钟；(4）当心地吸取其次、三部分的细胞。第一部分是顶部液体与40% Percoll之间，其次部分是40％与42.5 % Percoll之间，第三部分是42.5％与45％的Percoll之间，这两部分富含NK细胞；(5）用Hanks液洗2次，1000r/min,10分钟，细胞重悬于Hanks液中。【结果】CD56, CD57单抗间接免疫荧光发鉴定纯度，锥虫蓝拒染法测存活率，4℃存放备用。【注重事项】1．试验宜在4℃下举行，以保持细胞活力。2．普通用抗凝血，由于能更有效阻断补体系统在体外活化。